静息细胞生物转化甘油生产甘油酸

摘要：在单因素试验基础上，利用响应面设计法对日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonica）HD1025静息细胞转化甘油合成甘油酸的条件进行优化，并建立了各因素与甘油酸产量之间的数学模型。结果表明，采用静息细胞转化法生产甘油酸取得了较好的效果，且静息细胞浓度、甘油浓度、反应时间以及温度等对甘油酸产量均有不同程度的影响。响应面预测产甘油酸的最佳工艺为静息细胞浓度0.67%、甘油浓度160.74 g/L、温度30.10 ℃、pH值7.0、反应时间 3 d，此时甘油酸产量为33.83 g/L，与响应面极值吻合，表明优化方案达到了预期效果。

关键词：响应面设计；静息细胞；甘油酸；甘油

中图分类号： S188文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0216-04

随着化石能源的大量使用，石油等能源储量的减少，人们越来越关注可再生资源的开发，并且开始投入大量的精力来研发各种可以代替石油等化石燃料的可再生资源，其中生物能源的开发就是一条途径。然而在生物燃料的生产过程中会产生大约10%的副产物——甘油[1-2]。因此，在过去的10年间，越来越多的研究者开始探索能够将甘油转化成更有价值的化学物质的方法，其中利用微生物发酵法生产甘油酸就是一条重要的途径，微生物法生产甘油酸具有对环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性等优点，因此越来越受到关注。

甘油酸作为一种有机酸普遍存在于自然界各种各样的植物中，其衍生物（3-磷酸甘油酸）作为一种代谢产物存在于人体内。甘油酸及其衍生物具有很多的生物学功能，例如在人体内D-甘油酸能促进乙醇分解代谢，有文献报道称在狗体内的甘油酸具有胆固醇活性和肝兴奋剂的功能[3]。甘油酸衍生出的酯类低聚物能表现出抗胰蛋白酶活性[4]。在食品方面，甘油酸可以作为一种食品添加剂。所以氧化甘油生产甘油酸，既可充分利用生物燃料行业的废弃物，又具有很大的市场潜力。

国外有关微生物法生产甘油酸的报道较少，其中报道较多的4株菌株为热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）NBRC16470[2]、葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter sp.） NCBR3259[3]、氧化葡萄糖酸桿菌（G. oxydans） NBRC3292[1]、费拉托葡萄糖酸杆菌（G. frateurii） NBRC3262[1]，它们生产甘油酸的产量分别为22.7、33.7、32.6、57.2 g/L。国外有关微生物法生产甘油酸的报道主要是以微生物生长细胞直接转化法来生产甘油酸，该方法也存在一些问题，如培养基成分复杂导致反应體系杂质多，后期除杂困难，不利于产物的提取等。而静息细胞转化法是以微生物整体细胞作为反应催化剂，对外源底物进行结构修饰的微生物转化，除具有反应条件温和、选择性强、无污染、成本低、副产物少等优点，还可有效地提高下游产物的处理效率，降低提取成本。其原理是静息状态的微生物是限制性营养物质中静息细胞在非生长条件下的代谢，在这种状态下的微生物由于缺乏某些必需的营养成分使细胞不能繁殖，但因含有各种酶系统，细胞仍能转化其他营养物质[5-8]。目前，国内外尚未发现用静息细胞转化法转化甘油生产甘油酸的详细报道。

在笔者所在课题组前期的研究中，已从腐烂的蔬菜中筛选获得1株能够生产甘油酸的菌株Gluconobacter japonicas HD1025，本试验主要利用静息细胞培养法转化甘油生产甘油酸并利用SAS软件进一步优化转化条件，探讨各因素的交互效应，得到较优的条件组合。

1材料与方法

1.1试验材料

菌种：日本葡萄糖酸杆菌HD1025，由笔者所在实验室从腐烂的蔬菜中分离获得。

甘油酸（分析纯，日本东京化成工业株式会社），甘油（分析纯，购自郑州派尼化学试剂厂），蛋白胨（生化纯，购自北京奥博星生物技术有限责任公司），CaCO3（分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司），KH2PO4（分析纯，购自天津市光复科技发展有限公司）等。

种子培养基：5 g/L葡萄糖，5 g/L酵母粉，5 g/L蛋白胨，1 g/L MgSO4·7H2O，pH值为6.5，115 ℃灭菌20 min。

1.2试验方法

1.2.1静息细胞的制备按5%接种量将HD1025接入种子培养基的摇瓶中，30 ℃恒温培养10 h后，8 000 r/min离心 15 min，弃上清液，收集菌体用无菌水洗涤3遍，制得静息细胞，4 ℃冷藏备用。

1.2.2静息细胞初始培养条件静息细胞浓度为0.5%；培养体系为100 g/L甘油，3 g/L KH2PO4，15 g/L CaCO3，pH值为7.0，在30 ℃恒温振荡摇床中220 r/min培养3 d。

1.2.3发酵液中菌体细胞浓度的测定通过测定细胞吸光度得到细胞浓度。将发酵液稀释适当倍数，用分光光度计于600 nm处测吸光度，D600 nm =稀释倍数×分光光度计读数。量取一定量的不同吸光度菌体悬浮液，离心弃上清液后于105 ℃烘干至恒质量，此时的质量即为细胞干质量，计算D600 nm与细胞干质量的关系。

1.2.4甘油和甘油酸的检测甘油和甘油酸的检测方法参考文献[9-10]。

1.2.5静息细胞浓度对转化甘油酸的影响将静息细胞浓度设定为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其他条件不变，按照“1.2.2”节中方法进行转化，利用高效液相色谱（HPLC）测定甘油酸的含量，考察静息细胞浓度对甘油酸产量的影响。

1.2.6pH值对转化甘油酸的影响在最适的静息细胞浓度的基础上，将pH值分别设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他条件不变，按照“1.2.2”节中方法进行转化，然后检测甘油酸含量，考察pH值对甘油酸产量的影响。

1.2.7温度对转化甘油酸的影响在最适静息细胞浓度和最适pH值的基础上，将温度设定为15、20、25、30、35、40 ℃，其他条件固定不变，按照“1.2.2”节中方法进行转化，然后检测甘油酸的含量，考察温度对甘油酸产量的影响。

1.2.8甘油浓度对转化甘油酸的影响在最适静息细胞浓度、最适pH值和适宜的温度的基础上，将甘油浓度设定为60、80、100、120、140、160、180、200 g/L，其他条件固定不变，按照“1.2.2”节中方法进行轉化，然后检测甘油酸含量，考察甘油浓度对甘油酸产量的影响。

1.2.9反应时间对转化甘油酸的影响选择最适静息细胞浓度和最适pH值，添加合适的甘油浓度和适宜的温度培养 5 d，每天取样检测甘油酸含量，考察反应时间对甘油酸产量的影响。

1.2.10响应面设计优化甘油酸转化工艺在单因素试验的基础上，将甘油酸转化工艺的主要影响因素综合在一起，以温度、甘油浓度和静息细胞浓度3个因素为自变量，以甘油酸产量为响应值，设计3因素3水平的试验，其他因素不变。试验设计如表1所示。

2结果与分析

2.1静息细胞浓度对甘油酸产量的影响

由图1可知，静息细胞浓度对甘油酸产量有较大影响，当静息细胞浓度为0.6%时，甘油酸产量达最大值，为 21.32 g/L，此后甘油酸的产量随着静息细胞浓度的增大而减少。当静息细胞浓度低于0.6%时，甘油酸产量随菌体浓度的增加而增加，因为随着细胞浓度增大，参加转化甘油酸反应的酶量也相应增大，从而加快转化甘油酸的速率；但是，过高的细胞浓度并不能提高酶的催化效率。在转化过程中，氧气也是必需的底物之一，单纯地提高菌体量并不能提高转化效率，相反，由于过多的菌体会影响溶液的传质效率，不利于转化的进行。随着细胞浓度的进一步增加，甘油酸产量降低，是由于细胞浓度过高造成细胞膜的破裂影响酶活，从而降低甘油酸产量。因此，静息细胞浓度选择0.6%。

2.2初始pH值对甘油酸产量的影响

由于甘油酸属于有机酸，在发酵过程中pH值低于3时会严重影响菌体的生长和甘油酸的产量，因此，本试验在发酵过程中添加CaCO3来调节发酵液的pH值。初始pH值对甘油酸产量的影响如图2所示，可见不同初始pH值对甘油酸產量的影响较小。

2.3温度对甘油酸产量的影响

由图3可知，温度对静息细胞产甘油酸有很大的影响，当温度在30～35 ℃之间时，甘油酸产量达22.77 g/L，随着温度进一步升高，甘油酸产量明显下降，这可能是由于反应温度过高降低了酶活，导致甘油酸产量有所下降。较高的温度需要消耗更多的能量，出于节能方面的考虑，本试验选择最适温度为30 ℃。

2.4甘油浓度对甘油酸产量的影响

氧化葡萄酸杆菌转化制备甘油酸的底物是甘油，适当提高底物浓度，有利于提高甘油酸的产量，但若底物浓度过高，可能会对转化制备甘油酸产生抑制作用，从而降低甘油的实际转化率。如图4所示，随着甘油浓度的增加，甘油酸产量逐渐增加。当甘油浓度为160 g/L时，甘油酸产量为 30.47 g/L，此后继续增加甘油浓度时，甘油酸产量却有所下降，这可能是因为高浓度甘油对静息细胞的酶活力有抑制作用，从而导致甘油酸产量、转化率降低。因此，甘油浓度选择 160 g/L。

2.5反应时间对甘油酸产量的影响

由图5可知，当反应时间为3 d时，甘油酸产量达 29.53 g/L，之后随着反应时间的延长，甘油酸产量达到平衡状态，几乎不再增加，从经济角度考虑，反应时间选择为3 d。

2.6响应面设计结果分析

单因素试验研究了培养基中各组分及培养条件对甘油酸产量的影响，由单因素试验结果可确定温度、甘油浓度和静息细胞浓度是影响甘油酸产量的主要因素。为研究这些单因素之间的相互影响，根据单因素试验所确定的这3个显著因素的变化范围，设计响应面分析试验考察温度、甘油浓度和静息细胞浓度对甘油酸产量的影响，明确这3个主要因素的最佳条件。

以甘油酸得率为响应值，根据甘油酸产量响应面设计试验结果（表2），用SAS统计分析软件进行多元回归分析，所得

响应面分析结果如图6所示，在一定范围内，随着甘油浓度、静息细胞浓度、温度的变化，甘油酸的产量呈先增后减的趋势，这说明3种显著因素相互作用后甘油酸的产量存在最大值，同时利用SAS软件进行分析寻找到甘油酸产量达到最大值时，相对应的3种显著因素的最适浓度。从表3中可以看出，用回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系显著，决定系数为98.47%，说明回归方程的拟合程度较好。

2.7验证试验

为了进一步研究最佳响应值的范围，预测3个因素的最佳理论浓度，进行脊岭分析[11]，得出回归模型存在最大值，甘油酸含量的最大估计值为34.04 g/L，此时静息细胞浓度、温度、甘油浓度的取值分别为0.67%、30.10 ℃、160.74 g/L。为了验证优化后转化条件的可靠性，分别进行3次验证试验，所得甘油酸产量的平均值为33.83 g/L，与预测产量相近。

3结论

目前微生物游离细胞转化工艺通常采用2种方法：一种是生长细胞转化法，另一种是静息细胞转化法。生长细胞转化法中微生物生长代谢产生一定量的代谢产物，给后期产品的分离提纯带来一定的困难。而静息细胞转化法是将微生物细胞发酵培养一定时间后，离心或过滤收集菌体静息细胞，然后将静息细胞悬浮于含有底物的水或缓冲液中进行生物转化。此法的优点是可以避免生长细胞对产物的降解作用，且产物后处理简单，没有培养基成分的污染，生产周期短，因而是微生物转化的一种主要方式。

本试验优化产甘油酸的最佳工艺条件：静息细胞浓度、温度、甘油浓度的取值分别为0.67%、30.10 ℃、160.74 g/L，pH值7.0，反应3 d，此时甘油酸的产量为33.83 g/L，比优化前的 20.16 g/L 提高了67.8%。

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