藁本内酯抗人肺癌A549细胞增殖作用研究

摘要：目的 探讨藁本内酯抗人肺癌A549细胞增殖的作用机制。方法 CCK-8法检测藁本内酯对A549细胞活力的影响，TUNEL法检测细胞凋亡率，Hoechst 33258荧光染色法观察A549细胞的形态变化，ELISA检测血管内皮生长因子（VEGF）含量，Western blot检测核因子-κB（NF-κB）、Bcl-2、Bax及磷酸化JNK蛋白表达。结果 15、30、60、120、180 μmol/L藁本内酯作用12、24、48 h能抑制A549细胞活力（P<0.05，P<0.01， P<0.001），并呈剂量及时间依赖（P<0.05，P<0.01）；30、60、120 μmol/L藁本内酯作用12、24、48 h，细胞凋亡率呈时间和剂量依赖（P<0.05，P<0.01）；经藁本内酯处理48 h后，A549细胞核可见明显凋亡形态，包括核皱缩、碎裂、亮蓝色荧光，染色质分割产生凋亡小体；30、60、120 μmol/L藁本内酯细胞核内NF-κB蛋白p65亚基表达升高、细胞内JNK蛋白磷酸化水平升高、抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低及促凋亡蛋白Bax表达升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。结论 藁本内酯通过抑制VEGF的表达而抑制肿瘤新生血管的形成，通过调控NF-κB蛋白表达及JNK蛋白磷酸化水平，降低Bcl-2/Bax比值，诱导肿瘤细胞凋亡。

关键词：藁本内酯；A549细胞；凋亡；血管内皮生长因子；核因子-κB

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0055-05

Antiproliferative Effect of Ligustilide on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells WANG Li-hong1，2， WU Xing-bin1， WANG Li1 （1.Pharmacy Department， Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China；2.Wuwei People’s Hospital， Wuwei 733000， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of ligustilide on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells and its mechanism. Methods CCK-8 method was used to detect the effects of ligustilide on activity of A549 cells. Apoptosis rate was measured by TUNEL. Nuclear morphological changes of A549 cells were observed by fluorescence microscope after staining by Hoechst 33258. ELISA was used to detect the VEGF levels after incubation with ligustilide. Western blot was used to detect the expression of NF-κB， Bcl-2， Bax and the protein expression of phosphorylation of JNK. Results A549 cell activity was significantly inhibited after incubated with 15， 30， 60， 120， 180 μmol/L ligustilide for 12， 24， 48 h （P<0.05， P<0.01， P<0.001） in a dose and time-dependent manner （P<0.05， P<0.01）；Apoptosis rate increased by 30， 60， 120 μmol/L ligustilide for 12， 24， 48 h in a dose and time-dependent manner；A549 cells treated with ligustilide for 48 h appeared the apoptosis forms， including nuclear shrinkage， beating， strong blue fluorescence staining， and the chromatin divided producing apoptotic body；30， 60， 120 μmol/L ligustilide increased the expression of p65 subunit of NF-κB protein in the nuclei and the phosphorylation levels of JNK protein， reduce the expression of suppression apoptosis protein Bcl-2， and raised the expression of pro-apoptotic protein Bax （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. Conclusion By inhibiting the expression of VEGF， ligustilide can inhibit the formation of tumor angiogenesis. By regulating the expression of NF-κB and the phosphorylation levels of JNK protein and reducing the ratio of Bcl-2/Bax， ligustilide can promote tumor cell apoptosis.

Key words：ligustilide；A549 cells；apoptosis；VEGF；NF-κB

基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划（096RJZA143）

通讯作者：王利，E-mail：lzuwangli@163.com

藁本内酯是当归、川芎等中药中主要活性成分之一，对心脑血管、循环系统及免疫功能均有较强的药理作用[1-2]。研究表明，藁本内酯具有抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖、转移及肿瘤的生长、浸润[3-5]。本研究以肺腺癌A549细胞为模型，观察藁本内酯诱导A549细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制，以期为临床藁本内酯治疗肺癌提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 药物与细胞

藁本内酯，天津士兰科技有限公司，纯度>98%；A549细胞购自ATCC。

1.2 主要试剂与仪器

CCK-8试剂盒，上海博谷生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、TUNEL试剂盒及人血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒，Roche公司；Hoechst 33258试剂盒，上海依科赛生物制品有限公司；细胞核和胞质蛋白提取试剂盒，生工生物工程上海（股份）有限公司；DMSO及胎牛血清（FBS），Gibco公司；兔抗人核因子-κB（NF-κB）、磷酸化-JNK（P-JNK）、Bcl-2及Bax抗体，Santa Cruz公司。荧光显微镜IX51（日本Olympus公司），ELx800酶标仪（美国BioTek公司），Z-323高速低温离心机（德国HERMLE公司），FCM流式细胞仪（美国BD）。

1.3 细胞培养

A549细胞在含10%胎牛血清和青霉素100 μg/L、链霉素100 μg/L的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2孵育。细胞贴壁生长，2～3 d传代1次。细胞生长至对数期时开始实验，待细胞生长至80%时，serum- starved 10 h后用于实验。

1.4 CCK-8法检测细胞活力

取对数生长期细胞，37 ℃预热，PBS洗3次， 0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，以100 μL/孔（6000 cells）接种在在96孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养，待细胞生长至80%时，serum-starved 10 h。给予含藁本内酯15、30、60、120、180 μmol/L的无血清培养基，继续培养12、24、48 h，溶剂对照给予稀释倍数与最大药物浓度相同的DMSO（下同）。除去含药/溶剂培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞2次，加入新的培养基，每孔加入10 μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育4 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD值）。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡率

取对数生长期细胞，以2 mL/孔（3×105 cells）接种在6孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养，待细胞生长至80%时，serum-starved 10 h。实验组给予藁本内酯30、60、120 μmol/L，继续培养12、24、48 h。1500 r/min离心5 min，收集细胞，用4%多聚甲醛固定细胞，置水平摇床上缓慢摇动30～60 min，重悬细胞，然后根据TUNEL试剂盒说明书采用流式细胞仪进行检测。

1.6 Hoechst 33258荧光染色法检测细胞核形态

细胞接种同“1.3”项。6孔板中置大小合适灭菌的载玻片。serum-starved 10 h后，实验组分别给予30、60、120 μmol/L藁本内酯，继续培养48 h。弃去培养液，用4%多聚甲醛在4 ℃条件下固定15 min，弃固定液养液，Hoechst 33258染色液室温条件下染色15 min。镜检。

1.7 ELISA检测血管内皮生长因子含量

细胞接种同“1.3”项。取对数生长期细胞，以2 mL/孔（3×105 cells）接种在6孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养，待细胞生长至80%时，serum- starved 10 h。实验组给予含藁本内酯30、60、120 μmol/L的无血清培养基，继续培养48 h。取培养液，1000 r/min离心5 min，除去细胞碎片及颗粒物，收集上清。根据VEGF试剂盒说明书进行操作。

1.8 Western blot检测核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2及Bax蛋白表达

按“1.3”项步骤收集细胞培养液，冰浴的PBS洗1遍，用细胞刮子刮下细胞，1000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，分别提取总蛋白和细胞核蛋白。在细胞沉淀中加入适量裂解液（含蛋白酶或磷酸酶抑制剂），冰浴裂解30 min，每隔10 min高速涡旋15 s。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA法测定样品中总蛋白浓度；用细胞核蛋白抽提试剂盒，根据说明书提取细胞核蛋白。上样量为40 μg。一抗（兔抗人NF-κB（p65）、P-JNK、Bcl-2、Bax均按1∶1000稀释）4 ℃过夜，二抗（1∶10 000稀释）37 ℃孵育2 h， ECL法显色。采用软件Image pro plus 6.0分析条带的积分光密度。

1.9 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，结果中“2.1”“2.2”项采用双因素分析，其余数据进行单因素分析及LSD-t组间检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 藁本内酯对A549细胞活力的影响

与溶剂对照组比较，予藁本内酯孵育12、24、48 h后，细胞活力均明显下降（P<0.05，P<0.01，P<0.001），说明藁本内酯能够抑制A549细胞的增殖，其IC50分别为121.98、89.99、62.70 μmol/L。藁本内酯对A549细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖性（P<0.05，P<0.01），两者之间无交互作用（P>0.05）。结果见表1。

2.2 藁本内酯对A549细胞凋亡率的影响

根据不同作用时间藁本内酯的IC50值，将浓度为30、60、120 μmol/L的药物作用于A549细胞12、24、48 h，检测细胞凋亡率。与溶剂对照组比较，藁本内酯能增加细胞凋亡率（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。结果见表2。

表1 各组不同时点A549细胞活力比较（—x±s，OD值）

组别浓度（μmol/L）n 12 h 24 h 48 h

溶剂对照组 41.29±0.092.16±0.092.45±0.10

藁本内酯组 1541.11±0.071.88±0.08*1.99±0.08*

3040.96±0.08**1.59±0.04**1.68±0.04**

6040.81±0.06***1.28±0.05**1.26±0.05**

12040.60±0.04***0.96±0.04***0.93±0.06***

18040.54±0.01***0.71±0.03***0.54±0.07***

注：与溶剂对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（下同）

表2 各组不同时点A549细胞凋亡率比较（—x±s，%）

组别浓度（μmol/L）n 12 h 24 h 48 h

溶剂对照组 4 5.69±0.988.42±1.0312.36±1.04

藁本内酯组 304 10.40±1.02*25.60±1.47**35.47±2.38**

604 22.45±1.60*35.79±2.43**47.69±2.33****

1204 45.64±2.08***51.16±2.81**60.36±3.08****

2.3 藁本内酯对A549细胞核形态的影响

溶剂对照组细胞核边缘完整，呈均匀弱蓝色荧光；药物作用48 h后，细胞核内可见浓染的颗粒块状强蓝色荧光。早期凋亡的细胞核呈波纹状或折缝样，部分染色质出现浓缩状态，晚期细胞核裂解为碎块，染色质分割产生凋亡小体。结果见图1。

注：A.溶剂对照组；B.藁本内酯30 μmol/L组；

C.藁本内酯60 μmol/L组；D.藁本内酯120 μmol/L组（下同）

图1 藁本内酯作用48 h各组A549细胞核形态

（Hoechst 33258染色，×200）

2.4 藁本内酯对A549细胞培养上清液中血管内皮生长因子含量的影响

与溶剂对照组比较，给予30、60、120 μmol/L藁本内酯作用48 h后，VEGF含量下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。

表3 藁本内酯作用48 h VEGF含量比较（—x±s，pg/mL）

组别浓度（μmol/L）n VEGF

溶剂对照组 450.45±0.18

藁本内酯组 30440.61±0.24*

60437.71±0.40**

120435.78±0.16**

2.5 藁本内酯对核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

30、60、120 μmol/L藁本内酯作用48 h后，细胞核中NF-κB p65亚基蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001），结果表明给予药物后NF-κB被激活移位至细胞核，发挥促凋亡作用。同时细胞中P-JNK蛋白水平升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.001），促凋亡蛋白Bax表达升高，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001），Bcl-2/Bax比值降低。结果见图2。

图2 各组A549细胞NF-κB（p65）、P-JNK、Bcl-2及Bax蛋白表达

3 讨论

本研究发现，藁本内酯能抑制A549细胞活力，其作用48 h的IC50是89.99 μmol/L。在Hoechst染色研究中发现藁本内酯作用48 h能够使A549细胞核浓密致染强蓝色荧光，使细胞核皱缩、分解，形成凋亡小体，并随着药物浓度的增加凋亡率升高，120 μmol/L藁本内酯凋亡率可达（60.36±3.08）%。

本实验进一步研究了藁本内酯诱导A549细胞凋亡的机制。肿瘤细胞的增殖、转移依赖新生血管的形成，VEGF是目前已知最有效的促血管生长因子，对肿瘤新生血管形成及肿瘤生长、浸润、迁移起重要作用。VEGF促进肿瘤新生血管形成与肿瘤发病机制有确定性的关系。因此，针对VEGF/VEGF受体这一途径为靶点寻找抑制剂，阻断VEGF信号传导，能够达到抑制肿瘤生长的目的。研究表明，一种VEGF受体抑制剂SU6668能够增加胰腺癌肿瘤细胞的凋亡，降低肿瘤微血管的密度[6]，川芎的主要活性成分可以下调VEGF的表达[7]，当归挥发油中的活性成分之一丁烯酯酸内醋具有抑制新生血管形成的作用[8]，提示通过抑制肿瘤血管的生成来抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤作用。本实验结果显示，藁本内酯可以降低A549细胞培养上清液中VEGF的含量，提示这可能是藁本内酯诱导A549细胞凋亡的机制之一。

细胞凋亡是细胞内的程序死亡，哺乳动物细胞凋亡途径分为线粒体途径（或内在途径）、内质网应激介导的细胞凋亡及死亡受体途径（或外在途径）。在死亡受体途径中，首先配体诱导细胞表面的死亡受体，如肿瘤坏死因子受体家族三聚体化，在细胞膜上形成凋亡诱导复合物激活下游的Caspase8分子，进而引起随后的Caspases级联反应，引发细胞凋亡。NF-κB是核因子蛋白家族重要的一员，在细胞静息状态下以无活性三聚体p50/p65/IκB结合的形式存在于细胞质中，外来因素如炎症因子、生长因子或趋化因子刺激时p50/p65被释放出来并发生核移位，进而调控凋亡相关基因转录及蛋白表达；或在细胞外信号刺激下激活NF-κB诱导激酶，活化NF-κB，使其进入细胞核，促进NF-κB依赖的基因转录，诱导细胞发生凋亡[9]。NF-κB参与细胞增殖、细胞凋亡等过程是由肿瘤坏死因子受体家族通过死亡受体途径介导。在本研究中发现，30～120 μmol/L藁本内酯预作用48 h后，A549细胞核中NF-κB p65亚基蛋白表达显著增加，推测藁本内酯能够活化NF-κB，使其移位至细胞核内，发挥促凋亡作用。藁本内酯通过何种途径激活NF-κB还有待进一步的深入研究。

肿瘤坏死因子受体相关蛋白2还可以直接或间接激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路，通过三级酶促级联反应，即Ras/Raf/MEK/ERK途径激活JNK信号转导通路[10]，而后作用于线粒体，促使细胞色素C释放，即通过线粒体凋亡途径，最终导致细胞凋亡。凋亡调节基因Bcl-2家族中Bcl-2生理功能是通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用，而Bax基因是属于Bcl-2家族促细胞凋亡基因。Bcl-2/Bax镶嵌在线粒体膜上，调控线粒体功能。JNK可以通过直接磷酸化激活Bim/Bmf，再通过Bax/Bak来发挥作用[11]。本实验结果表明，藁本内酯促使细胞中JNK蛋白磷酸化水平升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达升高。提示藁本内酯诱导A549细胞凋亡的机制可能是通过JNK蛋白磷酸化后进入细胞核激活下游凋亡靶基因及蛋白转录表达，即转录依赖的方式；或是通过JNK活化后直接调控凋亡相关基因Bcl-2/Bax的表达，促进细胞凋亡。

综上，藁本内酯通过抑制VEGF的表达抑制肿瘤新生血管的形成，通过调控死亡受体途径中的NF-κB蛋白的表达及线粒体途径中P-JNK蛋白水平，降低Bcl-2/Bax比值诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。藁本内酯作为一个潜在的抗肿瘤药物，其作用机制有待进一步深入研究。

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（收稿日期：2014-12-02；编辑：华强）

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