基于1H,NMR的代谢组学方法对大鼠砒霜给药后血清的研究

摘 要：运用代谢组学方法研究了Wistar大鼠灌胃给药砒霜2和10 mg/kg剂量血清代谢的变化。通过核磁共振技术检测大鼠血清的代谢指纹图谱，然后利用主成分分析法分析空白组和砒霜给药组的代谢物差异，研究不同剂量砒霜在大鼠体内的急性生物效应。结果表明，砒霜对大鼠的急性靶向器官是肝脏，随着剂量增大，毒性增强；低剂量给药导致氧化应激，高剂量给药诱导细胞凋亡；低和高剂量给药均出现糖、氨基酸及脂质代谢紊乱，且能量代谢异常。

关键词：代谢组学； 砒霜； 核磁共振； 血清； 主成分分析

1 引 言

1999年，Nicholson等提出代谢组学（Metabonomics）的概念，并将其定义为：对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定^[1]。如今，代谢组学已应用于疾病诊断、药物毒性、营养学等多个领域^[2～5]。代谢组学方法主要利用现代分析技术如GC-MS， LC-MS， HR MAS和1H NMR等，结合模式识别方法，对生物体液和组织进行系统检测和分析，从而得到生物体代谢物浓度随时间变化的信息^[6，7]。

砒霜为临床上应用广泛的矿物药，主要成分是As2O3及一些矿物质，主要用于治疗寒痰哮喘、疟疾、梅毒和痔疮等疾病。但研究表明，砒霜既能治疗急性早幼粒细胞白血病^[8]，又能诱导体内外的肿瘤细胞株凋亡^[9，10]；同时，As2O3是一个活性很高的分子，能与很多蛋白的巯基结合，对线粒体产生毒性作用，消除细胞膜电位，产生活性氧物质（Reactive oxygen species， ROS）^[11]。砒霜进入人体后能破坏某些细胞呼吸酶，强烈刺激胃肠粘膜、破坏肝脏，严重的会导致呼吸和循环衰竭。As被认为是毒性物质和致癌物，但对其毒性评价还不完全。主成分分析是毒性评价中常用的模式识别方法之一，利用它对体液1H NMR谱图数据进行处理和分析，能得到有价值的生物信息。本研究利用主成分分析法和基于1H NMR 的代谢组学方法^[12]，从分子水平对砒霜毒性和毒性作用机制进行研究。

3 结果与讨论

3.1 血清的1H NMR谱图及多元统计分析

血清的组成均一性高，几乎含有血液中所有的小分子化合物，通过CPMG序列得到的谱图，可以减弱生物大分子产生的谱线变宽的干扰，进而更好地研究血清中代谢物浓度变化过程。图1为砒霜2和10 mg/kg剂量给药48 h后及对照样本血清的1H NMR谱图谱峰，参考文献[13，14]进行谱峰归属。

低剂量破坏了大鼠的能量代谢，葡萄糖能够快速补充能量，葡萄糖升高说明砒霜抑制了机体能量代谢，肌酸与磷酸结合生成磷酸肌酸，迅速补充ATP在血液中的含量，血清中较低浓度的肌酸，说明肌肉能量代谢过程可能受到抑制。低剂量的葡萄糖升高也与葡萄糖有氧糖代谢受阻有关。丙酮酸可通过糖异生作用生成葡萄糖，也可由糖酵解途径生成，丙酮酸升高与糖代谢异常相关。低剂量氨基酸代谢紊乱，谷氨酰胺（Gln）是体内含量最丰富的非必需氨基酸，约占体内总游离氨基酸的50%，Gln的变化直接影响机体总氨基酸的代谢，N-乙酰基糖蛋白、异亮氨酸和丙氨酸浓度的变化，同样反映了氨基酸代谢紊乱。砒霜中的砷为一种细胞原浆毒，进入机体后与细胞酶系统中的巯基结合，形成稳定的巯基化合物，本研究出现了糖及氨基酸代谢发生紊乱，可能与糖和氨基酸代谢的酶系统破坏有关。

3.2.2 高剂量组给药代谢学分析 通过图3可以找出高剂量给药后48 h的生物标记物：浓度升高的代谢物有LDL、 VLDL、NAC2、脂质、不饱和脂质；浓度降低的代谢物有缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、乙酸、NAC1、丙酮酸、谷氨酰胺、肌酸、胆碱、TMAO、甘油磷脂酰胆碱、葡萄糖、乳酸。

高剂量砒霜给药48和96 h后，在大鼠血清1H NMR谱中均观察到脂类及脂蛋白信号增强，这与脂代谢异常有关。Wei等^[18]研究雄黄 （As4S4） 给药后大鼠血清的1H NMR谱时，发现脂类及脂蛋白信号峰增强，说明雄黄会诱导细胞的凋亡。本实验也出现了脂类及脂蛋白信号峰增强现象，表明高剂量砒霜同样会诱导细胞凋亡，与As2O3主要是通过诱导白血病细胞分化和促使其凋亡而发挥治疗作用^[19]相同。

胆碱是体内重要的甲基供体，无机砷进入大多数哺乳动物体内后，其代谢过程涉及一系列甲基化反应。通过S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosglmethiomine， SAM）提供甲基官能团给砷，生成胂酸和二甲胂酸，并随尿排出体外，此过程是砷的主要代谢途径^[20，21]。本研究中高剂量组血清中胆碱降低，说明了高剂量砷在血清中发生了甲基化反应。

高剂量组中还观察到葡萄糖及氨基酸（丙氨酸、谷氨酰胺）代谢紊乱，表明As（Ⅲ）进入机体后与细胞酶系统中的巯基结合，形成稳定的巯基化合物。

肝脏具有代谢功能，糖、氨基酸及脂的代谢过程与其相关。本研究的低、高剂量组均发生肝脏代谢功能异常，对肝脏造成损伤。TMAO降低是肝脏受损的标志，在高剂量组中TMAO浓度变化，在低剂量组中浓度未发生变化，表明高剂量给药组比低剂量给药组对肝脏的损伤更严重。

乙酸是短链脂肪酸氧化的一个产物：乙酰乙酸+乙酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A+乙酸，高剂量血清中的乙酸浓度降低表明肝脏线粒体中进行的脂代谢发生紊乱，但是在低剂量组中肝脏线粒体的脂肪代谢未出现异常。

1927年，Warburg等^[22]发现癌细胞的能量代谢异常，即在有氧环境下，癌细胞优先进行糖酵解，并产生大量的乳酸，称之为“有氧糖酵解”，亦称为“Warburg效应”，被认为是癌细胞所具有的普遍特征。本研究观察到乳酸浓度升高，是否与砒霜致癌有关，需要进一步研究，但低、高剂量砒霜均造成能量代谢异常。

本研究表明，低剂量给药导致细胞氧化应激机制，而高剂量给药诱导细胞凋亡。高剂量给药对大鼠造成的肝脏损伤较低剂量严重，低、高剂量给药后均出现糖、氨基酸、脂代谢及能量代谢异常。低、高剂量给药48 h后对大鼠造成的毒性达到最大，给药168 h后对大鼠毒性作用恢复至给药前，表明低、高剂量砒霜给药的急性毒性作用是可恢复的，为砒霜的合理利用提供依据。

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