大鼠肝细胞癌变过程中survivin与livin的动态表达及相关性研究

广州医科大学附属第一医院肝胆外科，广东广州 510000

[摘要] 目的 探讨大鼠肝细胞癌变过程中survivin与livin的动态表达及其二者的相互关系。 方法 随机将100只SD大鼠分为模型组与对照组各50只，模型组大鼠给予0.01%DEN自由饮用18周诱导大鼠肝癌模型，对照组大鼠常规自由饮水，于4、8、12、16、18周分别处死模型组10只，对照组10只。采用免疫组化、RT-PCR、Western bolt法检测survivin和livin的表达。 结果 免疫组化结果显示：模型组大鼠survivin、livin表达总阳性率分别为82%（41/50）、86%（43/50），survivin与livin都表达于肝癌组织及癌旁肝组织中，且二者的表达重叠，Spearman相关分析表明，二者的表达有相关性（r=0.9027，P < 0.05）。RT-PCR检测结果显示，肝癌组织中均有survivin mRNA和livin mRNA表达，随着肝癌程度的加重而增加，与对照组肝组织比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。Western blot结果显示，survivin、livin的表达随着肝癌程度的加重而增加，对照组肝组织比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 survivin、livin在肝癌组织中高表达，且二者的表达密切相关，为肝细胞癌的临床治疗以及预后提供理论依据。

[关键词] 大鼠；肝细胞癌；Survivin；Livin

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）03（b）-0027-04

Dynamic expression and correlation of survivin and livin during hepatocellular carcinogenesis in rats

LI Feng WANG Wei JIANG Kaiwen ZHANG Longxin

Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510000， China

[Abstract] Objective To determine the dynamic expression and correlation of survivin and livin during hepatocellular carcinogenesis in rats. Methods 100 SD rats were divided into model group and control group with 50 rats in each group. Rats in the model group were given 0.01%DEN for drink induced model of liver cancer， while rats in the control group were given conventional water for drink. 10 rats in model group and control group were killed at 4， 8， 12， 16， 18 weeks respectively. Survivin and livin were measured by immunohistochemistry， RT-PCR， Western bolt. Results The results of immunohistochemistry showed that the total positive rates of survivin and livin were 82% （41/50）， 86% （43/50） in the model group， survivin and livin expressed in hepatic cellular cancer tissues and para-carcinoma tissue， the expression of them was overlapping. Spearman correlation analysis showed that the correlation between them was positive （r=0.9027， P < 0.05）. The results of RT-PCR showed that survivin mRNA and livin mRNA were expressed in hepatic cellular cancer tissues， increased with the liver cancer degree， compared with the control group， the difference was statistically significant （P < 0.05） .The results of Western blot showed that the expression of survivin and livin increased with the increase of hepatocellular carcinoma of liver tissue. There was statistically significant difference compared with the control group （P < 0.05）. Conclusion Survivin and livin are highly expressed in hepatic celluar Cancer tissues， and the expression of them are closely related. The results may provide a theoretical basis for the clinical treatment and prognosis of hepatocellular carcinoma.

[Key words] Rat； Hepatocellular carcinoma； Survivin； Livin

肝细胞癌（HCC）是临床中常见的肿瘤，大部分进展期的病例缺乏有效的临床治疗，日益受到重视[1]。无限的细胞增殖和损伤凋亡的不平衡是HCC重要的特征[2]。IAP家族是重要的凋亡抑制因子。目前已发现8种IAPs，作为家族的新成员，survivin被认为在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色；livin的研究则刚刚开始，其在肝肿瘤组织中的表达研究更不完善，在我国鲜有livin在肝癌组织中的研究报道。本文用免疫组化、Western bolt、RT-PCR法检测抗凋亡蛋白livin、survivin蛋白和mRNA在肝癌组织中的表达，探讨二者之间相互关系，从而为临床诊断和肝癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及建模 健康清洁级雄性SD大鼠100只（190～200 g），购自中山大学医学院动物中心，饲养于普通级实验室，标准饲料喂养。随机分为模型组、对照组，各50只。模型组大鼠0.01%DEN（饮用蒸馏水配制，Sigma公司产品，纯度为99.9%）自由饮水18周[3]建立大鼠肝癌模型。对照组大鼠常规自由饮水。分别在4、8、12、16、18周处死模型组、对照组大鼠各10只。取左肝迅速进行液氮冷冻后放入-80℃冰箱以备行Western bolt、RT-PCR检测，右肝进行固定、脱水透明、常规包埋，行免疫组织化学检测。

1.1.2 试剂 兔抗鼠livin抗体购自Sigma公司；兔抗鼠survivin抗体购自Abcam公司；Trizol购自Invitrogen公司；即用型SP试剂盒、DAB购自福建迈新生物制剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理学检查 标本常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色观察肝癌病变过程。

1.2.2 免疫组织化学法 切片脱蜡、水化，3%H2O2孵育后高压修复，兔抗livin、兔抗survivin作为一抗；应用SP免疫组织化学染色技术进行染色，DAB显色，苏木素复染。染色中以PBS代替一抗做空白对照，未见非特异性染色。

1.2.3 Western blot法 冰浴上（4℃）将肝组织剪碎，匀浆，超声破碎后，离心提取上清，用BCA试剂盒测量蛋白浓度，将样品置于-20℃保存，备用。变性后，上样总体积为20 μL，总蛋白量为100 μg，然后进行12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h，TTBS洗涤3次，用livin、survivin抗体孵育，4℃过夜。TTBS洗涤3次，与马抗大鼠IgG、兔抗大鼠IgG二抗，室温孵育2 h，TTBS洗涤3次后，与碱性磷酸酶反应3～5 min。晾干后，扫描，分析，保存。

1.2.4 RT-PCR法 取少量组织用液氮研磨成粉末，震荡、离心，吸取上层，加入异丙醇、乙醇离心、沉淀，-80℃冰箱保存。Trizol试剂提取总RNA，并进行RNA定量、RNA逆转录及cDNA合成，RT-PCR试剂盒检测survivin mRNA、livin mRNA水平。survivin引物上游：5"-CTTTCTCAAGGACCACCGCATC-3"，下游：5"-CAA TCCATGGCAGCCAGCTGC-3"，扩增片段为393 bp；livin引物上游：5"-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3"，下游：5"-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3"，扩增片段为312 bp；GAPDH引物上游：5"-AGCGCAAGTACTCCGTAGTG-3"；下游：5"-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3"；扩增片段为501 bp。产物经含溴乙啶的1.7%琼脂糖凝胶电泳，紫外线投射仪观察照相。

1.2.5结果判定 免疫组织化学切片由3名有经验的病理专家在双盲的情况下判定结果。免疫组织化学结果的判定，染色指数为染色范围与染色强度之和，分别以-、+、++和+++表示，（-）表示整张切片阳性细胞数<5%，未见细胞着色；（+）表示阳性细胞数占5%～25%，着色较弱；（++）表示阳性细胞数占> 25%～50%，着色较强；（+++）表示阳性细胞数>50%，着色强。RT-PCR结果以目的基因对GAPDH的相对积光密度值（T/N）记录。Western bolt结果分析采用Quantity One软件，计算各组蛋白表达条带的相对灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；采用Spearman相关分析二者的相关性。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 survivin、livin在模型大鼠肝组织中的表达

survivin、livin在模型大鼠肝组织中的分布见表1，其总阳性率分别为82%（41/50）、86%（43/50），survivin表达阳性的细胞呈敞在性或灶状分布，阳性颗粒呈黄色或棕黄色，位于细胞质中（图1，见封三），肝癌组织及癌旁肝组织中，均有表达。livin主要表达于肝癌组织细胞质中，与survivin的表达重叠（图1，见封三）。Spearman相关分析表明，二者的表达呈正相关（r=0.9027，P < 0.05）。

表1 免疫组织化学检测survivin、livin

在模型大鼠肝组织中的分布（只）

2.2 survivin、livin基因及蛋白在肝癌组织中的表达

RT-PCR检测结果显示，肝癌组织中均有survivin mRNA、livin mRNA表达，随着肝癌程度的加重其表达增加，在4、8、12、16、18周与对照组肝组织比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见图2。Western blot结果显示，肝癌组织中有survivin、livin蛋白表达，且随着肝癌程度的加重其表达增加，在4、8、12、16、18周与对照组肝组织比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

A

模型组 对照组

模型组 对照组

模型组 对照组

B

A：RT-PCR检测基因表达条带；B：两组基因表达情况的量化比较；0、1、2、3、4分别表示4、8、12、16、18周

图2 RT-PCR检测survivin mRNA及livin mRNA表达

3 讨论

肝癌的发生、发展是一个多基因、多阶段的演进过程，涉及多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前有大量研究证明，抗凋亡因子在实体肿瘤和癌症细胞系中表达增加[4]，如凋亡蛋白抑制因子（IAPs）家族。目前已发现IAPs家族包括8种：NAIP（BIRC1）、c-IAP1（BIRC2）、c-IAP2（BIRC3）、X-linked IAP（XIAP、BIRC4）、Survivin（BIRC5）、Apollon（BRUCE、BIRC6）、Livin/ML-IAP（BIRC7） 和IAP-like protein 2（BIRC8）[5]。

survivin是IAP家族中的重要成员，其可以抑制凋亡和调控有丝分裂，其在肿瘤组织以及分化差的成人组织中也有表达[6]。survivin在化疗引起的细胞凋亡中起很重要的作用，被公认为是恶性肿瘤进展的重要标志物，也被认为是抗肿瘤的靶标。有研究表明survivin是可以作为预测肿瘤预后的标志物[7-8]。

livin是IAP家族中的另一成员，有两种同源异构体，在JNK1的参与下，其通过抑制caspase-3、caspase-7和caspased-9，达到抗凋亡的作用[9]。有研究表明，livin在许多恶性肿瘤中有表达，包括肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神经母细胞瘤和肾细胞癌。然而livin在恶性肿瘤表达的临床意义不明确，在不同类型的肿瘤中，其与预后的关系仍然存在争议。也有研究表明，IAPs在肿瘤早期不起作用，而在进展期起重要作用[10]，其相互作用的机制可能是IAPs能使突变的细胞存活，从而导致肿瘤发生。在许多恶性肿瘤中都会有survivin 和 IAP的表达，他们与肿瘤的恶性细胞学特征紧密相连，如肿瘤浸润生长、总生存率的缩短、治疗抵抗、复发。体外实验中，livin的沉默能抑制HeLa细胞的增殖[11]。除此之外，有文献报道，以livin为目的si RNAs可以抑制人类肿瘤生长[8]。

本研究中survivin、livin在肝癌模型中总阳性率分别为82%（41/50）、86%（43/50），在肝癌组织及癌旁肝组织中，两者均有表达，且表达重叠。RT-PCR和Western blot结果显示，survivin、livin mRNA及蛋白表达随肝癌程度的加重而增加。推测survivin、livin与肝癌的严重程度相关，一定程度上可以反映肿瘤的严重程度，可以预测肿瘤的预后。相关性分析显示，survivin、livin表达呈正相关，提示其二者可能共同在肿瘤的发生发展中起作用。机制可能为，IAP家族的特征是有杆状病毒IAP重复序列（BIR）蛋白区域，是调节细胞凋亡、胞质分裂和信号转导的关键因素[7]。除了BIR区域，livin所含有的指环（RING）也可以使蛋白质与E3泛素连接酶作用。IAP的E3泛素连接酶活性表现为促进caspases与TRAF2的泛素化和蛋白酶体降解。抗IAP蛋白中最主要的是Smac蛋白，起着促凋亡等共同调节细胞增殖的作用。在激活凋亡级联反应时，线粒体释放细胞色素c和Smac，而survivin和livin相互结合共同使Smac发挥IAP抑制作用[12-14]。相反，在正常细胞中核蛋白XAF1与XIAP结合，从而抑制IAP的抗凋亡作用。笔者推测survivin和 livin在肿瘤细胞凋亡调节中具有一定的相互作用关系。

综上所述，survivin、livin在肝癌组织中高表达，且二者的表达密切相关，为肝细胞癌的临床治疗以及预后提供理论依据。

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（收稿日期：2013-05-10 本文编辑：程 铭）

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