溴氰菊酯和辛硫磷亚致死剂量对甜菜夜蛾酶活性的影响

摘要:研究了溴氰菊酯和辛硫磷亚致死剂量处理后,甜菜夜蛾羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化规律,结果表明:经辛硫磷亚致死剂量5.20 mg/kg和溴氰菊酯亚致死剂量0.73 mg/kg处理后,甜菜夜蛾体内CarE和GST均被不同程度的抑制,辛硫磷处理后24 h时与对照相比AChE活性下降了24.87%,而溴氰菊酯对AChE活性没有明显抑制作用。

关键词:甜菜夜蛾;亚致死剂量;羧酸酯酶;谷胱甘肽S-转移酶;乙酰胆碱酯酶

中图分类号:S433.5,Q965.9文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.012

Effect of Sublethal Doses of Deltamethrin and Phoxim on Enzyme Activity of Beet Armyworm

ZHANG Yuan-jian, WANG Zhen, ZHU Ao, ZHU Fu-xing

(College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China)

Abstract:Effect of sublethal doses of deltamethrin and phoxim on activities of carboxylesterase,glutathione s-transferase and acetylcholinesterase of beet armyworm, Spodoptera exigua (Hübner) were measured. There was a significant decline in CarE and GST activities 24 to 72 hours after treated with sublethal concentration of phoxim and deltamethrin. As for AChE, the activity decreased by 24.87% when compared with the check 24 hours after treated with sublethal concentration of phoxim, while sublethal concentration of deltamethrin had no significant inhibition on AChE activity.

Key words: Spodoptera exigua (Hübner); sublethal concentration; carboxylesterase; glutathione s-transferase; acetylcholinesterase

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner),属鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属(曾归贪夜蛾Laphygma),其别名贪夜蛾,是一种世界性杂食性害虫,极易产生抗药性,防治难度较大[1]。杀虫剂亚致死剂量处理昆虫后,除了对昆虫的抗性、行为以及生长发育等产生影响外,还会对昆虫体内的重要靶标酶如乙酰胆碱酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)以及谷胱甘肽S-转移酶(GST)等产生一定的影响[2]。本试验通过研究溴氰菊酯和辛硫磷剂亚致死剂量对甜菜夜蛾体内羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响,为深入研究甜菜夜蛾的抗性以及科学合理用药提供理论依据。

1材料和方法

1.1供试昆虫

供试甜菜夜蛾采自湖北,在实验室内人工饲养多代。在光周期L14:D10,温度(27±1)℃,湿度70%的条件下饲养,幼虫用人工饲料饲养[3],所用容器为24孔盘和120孔盘,成虫羽化后放置于罩有白色纱布的交配器中用5%的白糖水饲喂,白色纱布供成虫产卵。

1.2供试药剂及试剂

40%辛硫磷乳油(沧州中天化工有限责任公司生产);2.5%溴氰菊酯乳油(拜耳作物科学中国有限公司生产);碘化硫代乙酰胆碱(ATCh),5, 5-二硫-双-2-硝基苯甲酸(DTNB),毒扁豆碱(Eserine),考马斯亮蓝G-250(Coomassie Brilliant G-250),Fluka公司生产;1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB),α-乙酸萘酯(α-Naphthyl Acetate),固蓝B盐(Fast blue B Salt),医药集团上海化学试剂公司生产;α-萘酚(1-Naphthol),上海化学试剂采购供应五联化工厂生产;十二烷基硫酸钠(SDS),天津市凯通化学试剂有限公司生产;还原型谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH),武汉亚法生物技术公司分装;牛血清白蛋白(BSA),武汉生命技术有限公司生产;其它试剂为国内分析纯。

1.3仪器

分光光度计UV-1100,上海美谱达仪器有限公司生产;电子天平SHIMADZU,日本株式会社生产;CRG系列高速冷冻离心机,HITACHI公司生产。

1.4酶活性测定

1.4.1试虫处理取健康一致的同日龄(3龄)甜菜夜蛾幼虫,分别用辛硫磷的LC20浓度为5.20 mg/kg和溴氰菊酯的LC20浓度为0.73 mg/kg作为亚致死剂量。测定采用浸叶法,取新鲜甘蓝叶片,用清水洗净并自然凉干后在供试药剂中浸泡2 min,取出晾干备用,每个处理重复3次,以清水处理为对照,将晾干的叶片放入垫有湿滤纸的养虫盒中,并接入试虫,每盒15头,24 h后检查虫体死亡情况并换为人工饲料饲养,分别在0,24,48和72 h时取活虫制备酶液,其中0 h为接触药剂之前的3龄幼虫。

1.4.2酶源制备分别取经过亚致死剂量处理后不同时间的试虫(用药前3龄幼虫10头、用药后24 h 3龄幼虫8头,用药后48 h 4龄幼虫6头),放入玻璃匀浆器中,加入0.04 mo1/L,pH 7.0的磷酸缓冲液(PBS)5 mL冰浴匀浆,匀浆液在4℃下,10 000 r/min离心10 min,取上清液作为酶源。

1.4.3羧酸酯酶活性测定取适量稀释后的酶液1 mL,加入3×10-4 mol/L的α-乙酸萘酯(α-NA)底物1.0 mL和10-4 mol/L毒扁豆碱0.01 mL,混匀后于37 ℃恒温水浴中反应10 min,然后加入0.5 mL显色液(1%固蓝B盐溶液∶5%十二烷基硫酸钠溶液=2∶5,现用现配),摇匀后静置15 min,于600 nm处比色测定,以磷酸缓冲液取代酶液作为对照[4,5]。以α-萘酚作标准曲线,根据标准曲线方程求得酶促反应生成的α-萘酚量,然后计算出羧酸酯酶的活性。

1.4.4谷胱甘肽S-转移酶活性测定取2.78 mL 0.01 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液,0.1 mL 0.05 mol/L还原型谷胱甘肽(GSH),1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)丙酮液(0.05 mol/L)0.02 mL ,以及0.1 mL 酶液混合均匀后加入比色杯中,在340 nm处调零,每隔1 min记录1次吸光度值,共记录3次[6,7]。取第3分钟时吸光度变化值,根据GST活力[μmol/(mg·min)]= (△OD×V)/(ε×L) / 酶液蛋白质含量来计算酶活性。其中,△OD为每分钟吸光度的变化值(OD340/min),V为酶促反应体积(3 mL),ε为产物的消光系数[0.009 6 L/(μmol·cm)][8],L为比色杯的光程(1 cm)。

1.4.5乙酰胆碱酯酶活性测定反应体系总体积0.2 mL ,反应体系组成为:0.1 mL 酶液,0.1 mL 的0.75 mmol/L底物(碘化硫代乙酰胆碱),30℃下反应15 min,加入1.8 mL DTNB-磷酸盐-乙醇(称取0.012 4 g DTNB加入120 mL 96%乙醇,80 mL 蒸馏水,用0.1 mol/L pH 7.6磷酸缓冲液定容至250 mL)。在412 nm处比色测定,以磷酸缓冲液取代酶液作为对照[9]。根据乙酰胆碱酯酶活力[nmol/(mg·min)]=(△OD×V)/(ε×L)/酶液蛋白质含量来计算酶活性。其中,△OD为每分钟吸光度的变化值(OD412/min),V为酶促反应体积(2 mL),ε为产物的消光系数[1.36×104 L/(mol·cm)][10],L为比色杯的光程(1 cm)。

1.4.6 蛋白质含量测定考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[11],以牛血清白蛋白为标准蛋白。

2结果与分析

经辛硫磷亚致死剂量LC20(5.20 mg/kg)和溴氰菊酯亚致死剂量LC20(0.73 mg/kg)处理后,甜菜夜蛾幼虫的死亡率分别是15.87%和17.46%。

2.1杀虫剂亚致死剂量对甜菜夜蛾幼虫羧酸酯酶活性的影响

从图1可以看出,经辛硫磷亚致死剂量LC20处理后甜菜夜蛾幼虫羧酸酯酶活性在24 h时明显降低,与对照相比降低了77.58%,随后虽然略有回升,但与对照相比仍然较低。经溴氰菊酯亚致死剂量LC20处理后,甜菜夜蛾幼虫羧酸酯酶活性在48 h内持续下降,24 h时与对照相比降低了35.73%,在72 h时略有上升,但酶活性仍低于对照,经差异显著性分析,两种药剂处理后24~72 h之间羧酸酯酶活性均低于对照,且差异显著。另外,辛硫磷处理后羧酸酯酶活性下降的幅度大于溴氰菊酯,且差异显著。

试验中,随着时间的变化,对照的3种酶活性都出现了不同程度的下降,尤其是在24~48 h时下降幅度最大,通过试验中的观察,48 h时的甜菜夜蛾幼虫已经从3龄进入4龄阶段,这与彭梅等[12]的研究结果——甜菜夜蛾在低龄幼虫时体内的靶标酶和代谢酶活性高于高龄幼虫是一致的。

2.2杀虫剂亚致死剂量对甜菜夜蛾幼虫乙酰胆碱酯酶活性的影响

从图2中的结果可以看出,经辛硫磷亚致死剂量LC20处理后甜菜夜蛾幼虫乙酰胆碱酯酶活性在72 h内持续降低,始终低于对照,24 h时比对照下降了24.87%,差异显著;48 h时对照的酶活性下降幅度略大于辛硫磷处理,二者间差异不显著;到72 h时差异又达显著水平,这种动态变化说明,辛硫磷处理后甜菜夜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性处于动态变化中。经溴氰菊酯亚致死剂量LC20处理后甜菜夜蛾幼虫乙酰胆碱酯酶活性在24 h时与对照相差不大,之后的酶活性略低于对照,但差异不显著。可见,辛硫磷对甜菜夜蛾幼虫体内的乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制作用,而溴氰菊酯没有明显的抑制作用。

2.3杀虫剂亚致死剂量对甜菜夜蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶活性的影响

由图3可以看出,经辛硫磷亚致死剂量LC20处理后,甜菜夜蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶活性在72 h内持续下降,均低于对照,24 h时比对照降低了12.21%,经溴氰菊酯亚致死剂量LC20处理后,甜菜夜蛾幼虫谷胱甘肽S-转移酶活性在24 h时降到最低,比对照降低了30.46%,之后出现上升趋势,但是仍低于对照。经差异显著性分析,两种药剂处理与对照间均达显著水平。辛硫磷处理对谷胱甘肽S-转移酶活性的影响始终大于溴氰菊酯,其中,24 h和72 h时差异显著。

3小结与讨论

乙酰胆碱酯酶是昆虫体内重要的生化标记物,可以利用其活性变化监测杀虫剂对昆虫的亚致死效应,目前在亚致死状态下杀虫剂对昆虫体内AChE的时间效用研究较少。本研究结果表明,辛硫磷亚致死剂量对甜菜夜蛾AChE的活力存在抑制作用,这与亚致死剂量的辛硫磷对棉铃虫AChE活性没有诱导增加作用,反而使其活性下降一致[13]。而溴氰菊酯虽然在48 h后也表现出了一定的抑制作用,但抑制作用并不显著,这可能与乙酰胆碱酯酶不是拟除虫菊酯类的作用靶标有关,试验中表现出的抑制作用是由什么原因导致仍需进一步的研究。

谷胱甘肽S-转移酶是催化亲电子物质与内源还原型谷胱甘肽(GSH)结合的一类酶,在昆虫对杀虫剂的解毒中起着重要作用。本研究结果显示,亚致死浓度的辛硫磷和溴氰菊酯对甜菜夜蛾谷胱甘肽S-转移酶均有抑制作用,这与高希武等[14]用亚致死剂量的灭多威处理后3龄棉铃虫的 GST活性下降是一致的,但是用亚致死剂量的对硫磷处理 3龄棉铃虫幼虫24 h后,发现GST活性与对照组没有显著差异。Rumpf等[15]用氯氰菊酯亚致死剂量处理褐蛉幼虫后,发现其GST活性明显增加,而用苯氧威亚致死剂量处理后GST活性却明显降低。这说明亚致死剂量的不同杀虫剂对不同昆虫的GST活性的影响可能存在差异,有关不同杀虫剂对不同昆虫的GST活性影响的生物化学和分子生物学机制有待进一步研究。

两种药剂亚致死剂量处理对甜菜夜蛾CarE有一定的抑制作用,这与高希武等[14]用对硫磷、马拉硫磷、倍硫磷、灭多威和溴氰菊酯等亚致死剂量处理棉铃虫48 h后其CarE比活力明显降低的研究结果基本一致。唐培安等[16]研究发现甲酸乙酯对米象成虫CarE的影响表现为先抑制后诱导的作用,这说明亚致死剂量的不同杀虫剂对不同昆虫的CarE活性的影响可能存在差异。李腾武等[17]的研究也表明,不同药剂对同种昆虫羧酸酯酶的抑制作用不同,同一种药剂对不同种群的抑制作用也不相同,关于药剂对羧酸酯酶具体影响的机理需要进一步的研究。

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