真空冷冻干燥对乳酸菌发酵稳定性的影响

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

L.fermentum grx08、L.casei grx12、L.rhamnosus LV108均由江苏省乳品生物技术与安全控制实验室分离保藏。

1.1.2 主要试剂及培养基

试剂，2-硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG）生工生物工程股份有限公司；Fluo3-AM荧光探针，美国Sigma公司；其他试剂均为国药集团的分析纯。

培养基，MRS（固体/液体）培养基；脱脂乳培养基。

1.1.3 仪器与设备

Bio-Tck ELX 800酶标仪，美国宝特公司；5804R型高速冷冻离心机，德国EPPENDORF公司；RLPHR1-2LD真空冷冻干燥机，德国Wertheim公司；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；PE-20 pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌活化

将冻存于-80 ℃冰箱的实验菌株接入MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h，革兰氏染色镜检是否有杂菌。确定无杂菌后，活化三代用于后续试验。

1.2.2 冷冻及真空冻干

参考蔡敬敬[2]的文献方法收集菌体，制备菌悬液。

真空冷冻干燥条件参考李宝磊[3]的文献方法，略有改进：将安瓿瓶放入超低温冰箱，-80 ℃预冻12 h后放入真空冷冻干燥机。主冻干隔板温度-5 ℃，冻干14 h，真空度10 Pa；解析干燥阶段隔板温度为5 ℃，干燥10 h，真空度为3.5 Pa。

1.2.3 乳酸菌上清及细胞粗提物的制备

将实验菌株以4 ℃、4 000 r/min条件离心15 min，分别收集上清及菌体。菌体超声破碎，条件为：PBS离心洗涤两次后，重悬于PBS中（1×109 CFU/mL），超声破碎功率23%，工作3 s停5 s，共10 min。超声后的液体以4 ℃、12 000 r/min条件离心15 min后去除沉淀，以0.22 µm的滤膜过滤后获得细胞粗提物。

1.2.4 活菌数测定

取冻干后的实验菌株于室温下融化，用液体MRS进行10-1～10-8梯度稀释，平板计数测定菌株活菌数[4]。每次试验取3个平行。

菌株存活率（%）=冷干后活菌数÷冻干前活菌数×100

1.2.5 发酵特性测定

将实验菌株按3%的接种量接种至脱脂乳培养基，42 ℃恒温培养并记录凝乳时间。凝乳完成后进行酸度滴定、pH测定及粘度测定。

酸度测定：参照国标GB5413.34-2010[5]的方法，用0.10 mol/L NaOH标准溶液进行滴定。

pH测定：室温条件下，用pH计平行测定3次，取平均值。

黏度测定：参照栾少萌[6]的文献方法进行测定。

1.2.6 对细胞关键酶的影响

1.2.6.1 β-半乳糖苷酶的测定

（1）ONP标准曲线的绘制，参照杨佳越[7]等人的文献方法进行绘制。

（2）β-半乳糖苷酶比酶活性测定[8]，取1 mL上清液/细胞提取物（适当稀释使OD420值在0.3以内）37 ℃水浴5 min，加入已预热至37 ℃、20 mmol/L的ONPG磷酸盐缓冲液（pH 7.0）1.0 mL，37 ℃水浴10 min后，立即加入3 mL 0.5 mol/L的Na2CO3终止反应。空白样为加酶液后先加入Na2CO3，再加入ONPG磷酸鹽缓冲液，于420 nm处测定OD值。

1.2.6.2 乳酸脱氢酶的测定

采用南京建成生物有限公司的LDH试剂盒进行测定，酶活单位以U表示。

1.2.7 对细胞膜通透性的影响

实验参考王飚[9]等人的文献方法采用荧光探针Fluo3-AM检测乳酸菌细胞内Ca2+浓度的变化。

1.2.8 数据处理与分析

实验数据均采用M±SD表示，结果采用SPSS17.0进行统计和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 菌株冻干前后的活菌数

真空冷冻干燥是一个综合的胁迫过程，真空冷冻干燥过程中形成的冰晶会引起菌体机械损伤、细胞完整性破坏等，导致菌体的存活率降低。适当添加冷冻保护剂可以提高菌体的存活率，从而保持菌体活力。实验采用8%蔗糖、60%甘油及15%脱脂乳混合液作为冷冻保护剂进行真空冷冻干燥，冻干前后的活菌数，见表1。

由表1看出，冷冻干燥后菌体在MRS培养基的活力相对于未冻干前有所下降，冻干前经过24 h培养后L.fermentum grx08、L.casei grx12及L.rhamnosus LV108的活菌数分别为：9.28、9.37和9.64。冷冻干燥后，同样经过24 h培养，三株乳酸菌的活菌数均明显减少。比较冻干前后活菌数的变化情况可知，冻干后发酵乳杆菌grx08及鼠李糖乳杆菌LV108的存活率较高，分别为93%、94%，相比较可知干酪乳杆菌grx12的存活率略低，为86%。3个菌株冷冻后存活率不同，这可能是由于不同种属的乳酸菌对真空冷冻干燥的抵抗力存在差异。

2.2 菌株冻干前后的发酵特性变化

将冻干前后的菌种按3%的接种量分别接种到脱脂乳中，比较样品的凝乳时间、pH、酸度和黏度，结果如图1所示。

从图1（a）数据可以看出，冻干前3株乳酸菌的凝乳时间都在7～9 h，相较差异不大。而冻干后凝乳时间都略有延长，其中干酪乳杆菌grx12的变化差异较大，冻干前平均8.8 h能完成凝乳，冻干后则平均需要10.83 h才能完成凝乳，这可能与其冻干后存活率显著降低有关。

由图中1（b）、1（c）可知，3株乳酸菌冻干后的凝乳酸度及pH相较冻干前并没有显著差异。冻干后凝乳时的酸度变化均在1 °T以内，pH的变化幅度也在

1.0以内。通常冻干后菌株由于细胞膜的通透性发生变化，维持细胞内外pH梯度的酶失活致使pH梯度破坏，导致pH产生变化[9]。试验中3株菌株胞内pH均值与正常菌体差异不明显，可能与其添加了保护剂有关。

乳中的蛋白质在酸性条件下发生变性沉淀及乳酸菌代谢产生胞外多糖构成发酵乳的黏性特征[10]。由图1（d）可知，冻干后3株乳酸菌的粘度值有所降低，鼠李糖乳杆菌LV108的黏度值较为稳定，这可能与冻干后乳酸菌的存活率变化有关。

2.3 菌株冻干前后对细胞代谢关键酶活性的影响

2.3.1 菌体β-半乳糖苷酶活力的变化

β-半乳糖苷酶决定着发酵过程中的发酵速率，通过检测冻干前后乳酸菌菌体内外β-半乳糖苷酶活力的变化情况，可以确定冻干对乳酸菌发酵活力以及细胞膜通透性的影响。实验测定ONP标准曲线，结果如图2所示，冻干前后乳酸菌胞内外总酶活性的结果，见表2。

以ONP质量（µg）作为横坐标，OD420值作为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为y=0.201 7x-0.184，相关系数为0.999 7，线性关系较好，符合定量要求。

表2显示，真空冷冻干燥后3株乳酸菌的β-半乳糖苷酶胞外酶活力均有所增长，而胞内酶活力则全部降低，表明真空冷冻干燥会使乳酸菌的细胞膜通透性增加，从而引起代谢酶由胞内向胞外溢出。结合冻干前后菌株发酵特性变化的结果，显示真空冷冻干燥导致β-半乳糖苷酶酶活减弱，这可能是导致3株乳酸菌发酵特性发生改变的因素之一。

2.3.2 乳酸脱氢酶活力的变化

乳酸脱氢酶（LDH）被认为是糖酵解中的关键酶和限速酶[11]。检测冻干前后乳酸菌LDH总酶活性的变化情况，也是验证冻干对乳酸菌发酵活力以及细胞膜通透性影响的重要方式之一。实验分别测定了3株乳酸菌真空冷冻干燥后乳酸脱氢酶的活力，见表3。

表3显示，冻干后乳酸菌胞内LDH的总活力明显降低，L.fermentum grx08由冻干前的4.148 U降至3.185 U，

L.casei grx12由3.852 U降至2.815 U，L.rhamnosus LV108

冻干前后差异较大，由7.037 U降至4.667 U，说明乳酸脱氢在乳酸菌冻干后均受到了不同程度的损伤。乳酸脱氢酶活力的变化直接影响乳酸菌的发酵活力，因此冻干导致LDH活力的下降可能也是导致菌株发酵活力降低的原因之一。

2.4 对细胞膜通透性的影响

细胞膜受损后通透性增大会引起胞外Ca2+内流，胞内Ca2+浓度增加。实验采用Fluo3-AM荧光探针法测定冻干前后乳酸菌细胞内Ca2+的荧光强度（荧光强度随Ca2+浓度变化，且与Ca2+浓度成正比），结果见表4。

由表4可知，在相同的波长条件下，3株乳酸菌冻干前胞内的Ca2+荧光强度不同（即浓度）不同，但经过真空冷冻干燥处理后，变化趋势一致，3株乳酸菌胞内的Ca2+荧光强度均表现为增强。L.fermentum grx08、L.casei grx12及L.rhamnosus LV108冻干前的钙离子浓度依次为冻干后的68.29%、80.63%及84.66%，说明冻干后细胞膜的完整性遭到破坏，通透性有所增加。王飚等人[9]研究发现，冻干后胞内Ca2+浓度远高于正常细胞内的Ca2+浓度；正常菌体胞内Ca2+浓度仅为冻干菌体的22.4%；但添加保护剂后相对未添加保护剂的菌体降低约40.0%。本实验中乳酸菌冻干后的钙离子浓度没有大幅增加，可能与其添加了保护剂有关。

3 结论

本研究通过测定L.fermentum grx08、L.casei grx12及L.rhamnosus LV108 3株乳酸菌冻干过程中存活率、发酵特性、代谢关键酶及细胞膜通透性的变化情况，考察真空冷冻干燥对细胞关键酶的影响，以及细胞膜通透性改变对乳酸菌发酵特性的影响。结果显示，冻干后细胞存活率降低，凝乳时间延长粘度值下降，但凝乳时的酸度及pH变化不大。另外，细胞的两种代谢关键酶β-半乳糖苷酶及乳酸脱氢酶总酶活均较冻干前有所减弱，采用Fluo3-AM荧光探针法测得冻干后3株菌的Ca2+浓度增加，表明冻干后细胞膜的完整性被破坏，细胞膜通透性增大，这可能是导致菌株发酵性能降低的一個关键因素。

参考文献：

[1]黄 科.真空冷冻干燥乳酸菌的研究进展[J].西安文理学院学报，2009，12（3）：49-52.

[2]蔡敬敬.鼠李糖乳杆菌的功能特性研究及RAPD分析[D].扬州：扬州大学，2009.

[3]李宝磊.真空冷冻干燥对乳酸菌损伤机制及关键保护技术研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2011.

[4]李松涛.食品微生物学检验[M].北京：中国计量出版社，2005.

[5]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准GB5413.34-2010.乳和乳制品酸度的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[6]栾少萌.嗜热链球菌grx02对酒精性肝损伤的保护作用及其应用[D].扬州：扬州大学，2010.

[7]杨佳越，周 丹，张柏林.贮藏温度对固定化乳糖酶活性的影响[J].中国乳品工业，2013（5）：19-21.

[8]郭清泉，张兰威，林淑英.普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β-半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究[J].食品工业科技，2002（3）：34-36.

[9]王 飚，田丰伟，励建荣，等.冷冻干燥对乳酸菌细胞膜通透性的影响[J].微生物学通报，2009，36（5）：684-688.

[10]徐爱才，马成杰，华宝珍，等.嗜热链球菌与不同乳杆菌组合在脱脂乳中的发酵特性[J].食品科学，2013，34（15）：158-161.

[11]McKay LL，Baldwin KA. Altered Metabolism in a Streptococcus lactis C2 Mutant Deficient in Lactic Dehydrogenase[J].Journal of Dairy Science，1974，57（2）：181-186.

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