药用植物青阳参可培养内生菌分离与多样性分析

材料与方法

1.1 供试植物样品

植物样品青阳参采自云南省楚雄市西山，海拔高度1 800 m。

1.2 培养基

细菌的分离培养用牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g，水1 000 ml，pH自然，加入两性霉素B以抑制真菌生长）。

真菌分离培养用PDA固体培养基（加入青霉素、链霉素以抑制细菌生长），真菌鉴定用PDA固体培养基、促孢固体培养基（KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KNO3 1 g、KCl 0.5 g、淀粉0.2 g、蔗糖0.2 g、葡萄糖0.2 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，pH自然）。

1.3 内生菌的分离、纯化和培养

采集健康、新鲜的叶、茎和根组织样品，冲洗干净，并且吹干表面水分。取适量无菌水、75%乙醇、0.1%升汞，分别放入预先灭菌的烧杯中，将植物叶、茎和根剪成长段，备用。样品先于75%乙醇中浸泡消毒，然后于0.1%升汞中浸泡消毒，将消毒完毕的样品在无菌水中连续清洗后晾干，剪成小块，用无菌的解剖刀从中间切开，使得植物内部尽量暴露。将剪好的小块分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基和PDA固体培养基平皿表面，同时用清洗消毒样品的无菌水涂布为对照，分别于37和28 ℃培养，挑取植物组织周围的菌落，对所分离的内生菌进行纯化，并且根据菌落形态特征和个体形态特征进行归类培养[6]。

1.4 内生菌的分类鉴定

内生细菌的鉴定参照文献[7-8]，同时依据菌落形态观察、革兰氏染色形态、荚膜和芽孢有无、动力学试验、生理生化特征等进行研究。

真菌鉴定采用平板插片法，将菌种接种于固体PDA和促孢固体培养基上，28 ℃培养，菌落长出时斜插灭菌盖玻片，培养后用镊子取下盖玻片在光学显微镜下观察显微形态特征，鉴定到属（分类检索参照文献[9-11]）。

2 结果与分析

2.1 不同部位分离出内生菌的数量分布

内生菌在不同组织中种群、数量分布有差异，共分离出内生菌56株，真菌34株，细菌22株；根中分离28株，茎中9株，叶中19株。在根、茎、叶中分别分离出细菌12、3、7株，分别分离出真菌18、4、12株。总的内生菌分离结果为根部最多，茎中最少。

有些种属在各个组织中均有分布，有些则表现出一定的组织专一性。叶中优势细菌种群为芽孢杆菌属和泛菌属，根中为土壤杆菌属、假单胞杆菌属和肠杆菌属。叶中优势真菌种群为交链孢属，根中优势种群为腐霉属。

2.2 内生菌种群组成多样性

通过菌落形态、染色镜检等，初步鉴定22株内生细菌属于6个属，包括土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、泛菌属（Pantoea sp.）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium）、假 单 胞 杆 菌 属（Pseudomonas），表明青阳参内生细菌具有生物多样性。

从植物根、茎和叶中，共分离获得34株内生真菌，其中25株内生真菌经形态学显微观察鉴定为12属（表1），说明青阳参植物内生真菌种类繁多，微生物资源丰富。在科一级分类水平上，以丛梗孢科和暗梗孢科为优势类群；在属的分类等级上，优势最明显的是交链孢属（Alternaria Nees），共有6株，占总菌株17.6%，其次是腐霉属（Pythium），共有5株，占菌株总数的14.7%。

3 结论

通过对青阳参植物内生菌的分离、鉴定，发现其内生菌种类多、数量大，微生物资源丰富。该研究不仅为发现新种，而且为筛选出具有生物活性天然产物的内生菌提供了丰富的资源。在青阳参植物不同的组织中内生菌有不同的分布，表现出一定的组织专一性。这可能与不同组织的生理结构和活性物质有关。鉴于内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似活性代谢产物，该研究将有利于促进植物内生真菌资源的研究与应用。随着野生青阳参植物的日益减少，从内生真菌出发，研究内生真菌与其的相互关系，筛选能够产生与宿主类似活性化合物的菌株，将具有重要的研究意义和应用意义。总之，随着我国的传统野生药用植物资源的日渐枯竭，通过对药用植物内生菌的分类学、生态学、代谢产物化学等进行系统的研究，将会极大地促进药用植物资源的开发和利用。

研究中存在的问题主要在于该次试验用的标本植株量较少，也未对不同区域、不同季节植株进行比较。内生菌的鉴定还需要采用分子生物学手段如16S rRNA、18S rRNA和ITS序列分析等进一步鉴定。这些工作还有待进一步研究。随着研究范围的扩大和研究的深入，更多的青阳参植物内生菌将会被发现、应用。

参考文献

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[2] RUKACHAISIRIKUL V，SOMMART U，PHONGPAICHIT S，et al.Metabolites from the endophytic fungus Phomopsis sp.PSUD15[J].Phytochemistry，2008，69：783-787.

[3] 黎丽云，殷志琦，张庆文，等.云南民间药青阳参的研究进展[J].海峡药学，2011，23（4）：1-5.

[4] 王斌，王德斌，翟书华，等.云南青阳参遗传多样性的AFLP 研究[J].中草药，2011，42（5）：985-989.

[5] 杨竹雅，普春霞，钱子刚.青阳参及其近缘种的RAPD 研究[J].中国现代应用药学杂志，2009，26（7）：562-566.

[6] 杨清香，谢永生，张昊，等.怀地黄活性内生菌的分离鉴定及抗菌抗肿瘤活性[J].微生物学通报，2010，37（10）：1467-1474.

[7] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[8] 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所翻译组，译.8版.北京：科学出版社，1984.

[9] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1982.

[10] 戴芳澜.真菌的形态和分类 [M].北京：科学出版社，1987.

[11] 邵力平，沈瑞祥，张素轩.真菌分类学[M].北京：中国林业出版社，1984.

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