霜霉病菌诱导大白菜几丁质酶和葡聚糖酶基因的表达

材料，采用实时定量PCR技术检测接种霜霉病菌（Peronospora parasitica）后几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的表达。结果表明，霜霉病菌接种处理显著诱导了几丁质酶基因在大白菜抗病品种中的表达，但β-1，3-葡聚糖基因的表达却呈现双峰曲线特点，表明这两种基因可能在大白菜对霜霉病抗性中起到了重要作用。

关键词：大白菜；病程相关蛋白；霜霉病菌；几丁质酶；β-1，3-葡聚糖酶；实时定量PCR

中图分类号：S634.103.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0096-04

AbstractThe gene expression of chitinase and β-1，3-glucanase in Chinese cabbage variety resistant to Peronospora parasitica were examined using real-time quantitative PCR （RT-PCR）. The results showed that chitinase gene expression was significantly induced by inoculation treatment， while β-1，3-glucanase gene expression showed a double-peak curve. It indicated that the two genes might play important roles in the resistance of Chinese cabbage to Peronospora parasitica.

Key wordsChinese cabbage； Pathogeneses-related proteins （PRs）； Peronospora parasitica； Chitinase； β-1，3-glucanase； Real-time quantitative PCR （RT-PCR）

霜霉病是大白菜第二大病害，是由病原菌Peronospora parasitica Pers. ex Fr.侵染引起的，春秋两季发生尤为严重，可造成高达90%产量损失1。该病菌生理小种进化非常迅速2，采用常规抗性育种和化学药物防治并不总是有效3～5，因此通过远缘杂交或引入抗性基因成为增强作物对真菌病菌生理小种抗性最有效的方法6。大白菜抗病品种“新烟杂3号”是烟台地区一种重要的对真菌病害具有广谱抗性的材料，其抗性性状已通过杂交转移到其它感病品种，获得了一些对真菌病害表现出不同抗性的近等位基因系，这些材料已成为研究大白菜对霜霉病抗性最好的遗传材料。

植物经过长期进化形成复杂而有效的防御机理以抵抗病原菌侵染，包括结构抗性、生理生化抗性以及分子抗性7。分子抗性即基因抗性，是寄主植物通过抗病基因（R）与感病基因（r）互作而表现出的一种抗病性形式7。抗性基因分为微效基因和主效基因，研究抗性微效基因存在较大困难，因此当前主要研究的是抗性主效基因的鉴定、分离、克隆及表达，在此基础上深入研究抗性基因的功能及其作用机制尤为重要8。在诱导植物抗性基因研究中，主要表达的是防卫素和病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）基因9。由于PRs的诱导表达与植物系统获得抗性（Systemic acquired resistant，SAR）紧密相关10～12，因此PRs基因的诱导表达和转PRs基因增强植物抗病性成为当前研究热点13～15。在已经获得的11类PRs中，绝大部分具有几丁质酶和葡聚糖酶活性，但不同植物中这些基因受病原菌或外源物质诱导表达的特点却各有不同12，因此病原菌与寄主之间的相互作用机制以及PRs基因与之的关联性和协同性是研究的重点。

本研究将大白菜中两种重要的PRs基因对霜霉病菌的抗性关系进行了研究，以期为未来这两种基因在大白菜抗真菌病害基因工程中的应用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为大白菜抗病品种“新烟杂3号”，由中国农业大学烟台研究院提供。大白菜种子经0.1% HgCl2消毒后，于人工气候箱在20～25℃、12h/12h光周期、60%相对湿度条件下培养，待幼苗长至4～6片真叶时用于试验。

1.2真菌接种液的制备和接种程序

霜霉病菌（P. parasitica）接种液的制备参照王彦华等16的方法，最终配成1×105个/mL孢子囊悬浮液。处理组每个单株叶片用棉棒涂抹约100 μL的诱导液，对照组用纯水代替。诱导处理后植株需遮光、保湿处理24 h，然后揭掉遮光物，于人工气候箱在20～25℃、12h/12h光周期、相对湿度（85±5）%条件下培养，直至采样结束，每处理重复3个。

1.3实时定量PCR检测P. parasitica诱导几丁质酶和葡聚糖酶基因表达特征

1.3.1引物设计在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和GenBank大白菜数据库中选取所需几丁质酶基因、β-1， 3-葡聚糖酶基因，以大白菜肌动蛋白Actin基因为内参，利用Primer 5.0软件进行引物设计，引物序列见表1。

1.3.2总RNA提取和cDNA合成利用Trizol reagent（Invitrogen， 上海）分别提取P. parasitica侵染处理和纯水处理0、6、12、24、36、48、72、96 h 的大白菜叶片，利用逆转录酶将5 μg 总RNA 合成为cDNA。

1.3.3实时定量PCR反应体系和反应程序采用Bio-Rad CFX96 型荧光定量PCR仪检测几丁质酶和葡聚糖酶基因转录表达情况。RT-PCR反应总体系为20 μL（见表2），具体反应程序为：95℃变性3 min；95℃ 10 s，55.8℃ 30 s，40个循环；95℃ 10 s；53.8℃ 10 s；融解曲线测定从65℃到95℃。每处理重复3次，试验数据分析采用2-△△CT法进行相对表达量分析17。

2结果与分析

2.1P. parasitica侵染对大白菜几丁质酶基因表达的影响

从图1中可以看出，P. parasitica 可明显诱导几丁质酶基因在大白菜叶片中的表达。侵染后6 h几丁质酶基因表达量明显增加，诱导处理24 h后达到最高表达量，与对照相比表达量增加了近150倍。诱导处理36 h后表达量迅速下降，此后几丁质酶基因表达量一直维持在一个较高水平。

2.2P. parasitica 侵染对大白菜β-1，3-葡聚糖酶基因表达的影响

从图2中可以看出，霜霉病原菌侵染诱导β-1，3-葡聚糖酶基因表达特点呈现先升高后降再升高的特点。霜霉病菌接种后6 h，β-1，3-葡聚糖基因表达量与对照相比增加100%，诱导处理12 h表达量与对照相比降低了大约35%，处理24 h后达到最低表达量，只有对照的38%，此后β-1，3-葡聚糖基因表达量开始升高，侵染处理48～96 h，β-1，3-葡聚糖基因表达量均比对照高约100%，且最高点出现在诱导处理72 h。

3结论与讨论

PR蛋白最早是在病原菌侵染的植物中发现的，所以主要功能与植物的抗病性相关。几丁质酶和葡聚糖酶基因作为最重要的两种PRs基因参与植物的防御体系，可单独或共同作用一起抑制真菌生长18，二者通过降解真菌细胞壁主要成分β-葡聚糖和几丁质，从而导致真菌病原菌的降解、死亡19。

本研究采用P. parasitica侵染处理观察几丁质酶和葡聚糖酶基因表达情况，结果发现P. parasitica可明显诱导几丁质酶基因转录表达水平，且几丁质酶基因表达量一直处于较高水平，这与霜霉病菌诱导不结球白菜Bcchi表达特点相似20，区别在于大白菜几丁质酶基因在达到最高点后，呈现轻微波浪状降低趋势，也有研究者发现几丁质酶基因呈现双峰曲线表达特点21，22，这可能是不同的病原菌侵染或者不同信号传导途径导致。大白菜几丁质酶1基因的表达特点与class Ⅳ几丁质酶CHB4基因转录表达特点非常相似（结果未发表），而在水杨酸诱导处理的不结球白菜中class Ⅳ几丁质酶基因表达量增加明显，参与植物SAR抵御Alternaria brassicicola的侵染23，这些都说明大白菜几丁质酶1基因与SAR必然存在一定的关联性。

本研究发现β-1，3-葡聚糖酶基因转录表达呈现双峰表达特点，且表达量较对照增加不明显，而在P. parasitica侵染的不结球白菜16和青花菜24抗病品种中β-1， 3-葡聚糖酶基因呈现单波表达特点。在番茄和烟草中β-1，3-葡聚糖酶基因均容易受到真菌病原菌诱导且表达量较正常植株明显增加25，26。本研究中β-1，3-葡聚糖酶基因转录表达不明显，有研究者认为可能由于葡聚糖酶在植株中以低水平组成型表达18， 27，且β-1，3-葡聚糖酶的表达受限于宿主或品种专一性28，在烟草中就发现对TMV高度敏感基因型可明显诱导该基因表达27，也有研究者发现β-1，3-葡聚糖酶表达具有组织特异性，在幼嫩的茎叶表达量较少，在老叶中有较高的表达量29，30，这也与本试验结果相符。

本研究对大白菜几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的诱导表达特点进行了研究，由于几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因构建的双价表达载体已在许多作物中验证了其抗真菌病害特性13～15， 31，32，因此本研究也为未来构建这两种基因双价表达载体进行大白菜抗真菌病害研究提供了理论依据。通过对PRs基因的调控机理（包括组织表达特异性和发育阶段的调控）以及信号传导途径进行深入研究，必将有助于合理利用抗病基因进行抗病育种。

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