基于分子信标的DNA自组装模型研究

摘 要：分子信标操作简单且不必与未反应的探针分离即可进行实时检测，将分子信标与自组装结合，将为DNA计算研究提供新的思路及方法。本文介绍了基于分子信标的DNA自组装模型的算法思想，阐明了分子信标设计要点，描述了生物实现步骤，并对如何提高分子信标的检测准确性做了展望。

关键词：分子信标 自组装 DNA计算

中图分类号：TP2 文献标识码：A 文章编号：1673-9795（2014）05（a）-0115-02

Model Study of Self Assembled Molecular Beaeon Based on DNA

Zhang Wenyi Zhang Zhe Li Nan

（Anhui University of Science and Technolgy，AnhuiHuainan，232001 China）

Abstrat：Molecular beacon owns simple operation and can do real-time detection without separate the ueacted probes. The combination of molecular beacon and self-assembly will provide a new and effective method of studying DNA computing.This article introduces the algorithm ideas of DNA self-assembled model based on molecular beacon，clarifies molecular beacon design points，describes the biological implementation steps and do prospect of how to improve the detection accuracy of molecular beacons.

Key Words：Molecular Beacon；Self-Assembly；DNA Computing

自20世纪80年代中期开始并已完成的人类基因组计划为理解所有生命活动的分子机制奠定了基础。其中最早出现的是与DNA相关的基因组学，它是一门解码生命所有信息的新的前沿科学。基因是细胞和个体遗传信息贮存和传递的基本单位，遗传信息的载体是以DNA和RNA两大类核苷酸为基本组成单位的核酸。生命科学研究需要能够高灵敏度、高选择性地定量研究基因组和蛋白组的信息，而研究这些的基础是对核酸的研究检测。

核酸的基本组成单位为核苷酸，核苷酸间的差异主要是碱基不同，因此核苷酸序列可以用碱基序列表示。1953年，J.Watson和F.Crick发表了DNA双螺旋结构模型的论文[1]，这一发现既是分子生物学发展的里程碑，又是核酸分子探针的理论基础。分子信标作为一种新型的荧光探针，以特异性强、灵敏度高、操作简单、可对核酸进行实时定量测定、甚至可用于活体分析的特点在生物、医学等领域得到了广泛的应用和发展。

1 核酸杂交原理与分子信标

1.1 核酸杂交原理

DNA的变性与复性是核酸分子杂交的原理。在某些理化因素的作用下如温度、pH、离子强度等，DNA双链互补碱基对间的氢键断裂，使得DNA双螺旋结构成为单链的现象即为变性。DNA变性不改变它的核苷酸序列，只改变其二级结构。实验室最常用的方法之一是加热。DNA变性从开始解链到完全解链，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度。变性DNA在适当条件下，两条互补链重新配对恢复天然双螺旋构象的现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后复性的过程称为退火。DNA的复性速度受温度的影响，如要使其复性，需要温度缓慢下降。若在加热后将其迅速冷却至低温，则几乎不能复性。DNA复性的最佳温度一般认为比Tm低25℃。

1.2 分子信标

分子信标是1996年Tyagi和Krammer[15]首次提出的一种荧光核酸探针，又称为发卡探针。分子信标一般由环状区、茎杆区、荧光基团和猝灭基团三部分构成。环状区是一个长度为15-30碱基的环状寡聚核苷酸序列，可以特异性与目标分子结合，茎通常是长度为5-8碱基的互补序列，荧光基团与猝灭基团分别连在信标分子的5’端和3’端。自由状态时，茎杆区互补序列特异性结合形成发夹状结构，猝灭分子吸收荧光分子发出的荧光并以热能散发，荧光几乎完全被猝灭，检测不到荧光信号。当有靶序列存在时，分子信标的环序列可与序列完全互补的靶标分子形成比茎环结构更稳定的双链杂交体，茎杆互补区被拉开，荧光分子与猝灭分子因距离增大而分开。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。此时猝灭分子无法吸收荧光分子发出的荧光，信标分子的荧光几乎完全恢复，于是可检测到荧光，且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比（如图1、图2）。

2 DNA自组装

DNA分子自组装是指一些带有输入信息的DNA分子根据碱基互补配对原则，在一定的温度、浓度、酸碱度以及特定酶的作用下，自组装生成带有输出信息的新的DNA分子的过程。自组装本身就是在执行实际的计算，经由退火使DNA序列根据碱基互补配对原则进行结合是它的动力。自组装DNA计算模型是通过DNA分子间的相互作用形成特定的构型来完成计算过程，在思想上组合了DNA计算、Tiling理论和DNA纳米技术，在计算过程中，它避免了其它DNA计算模型所需要的大量实验操作次数，减少了操作带来的时间耗费和误差倾向，是目前备受关注的模型之一。

3 基于分子信标的DNA自组装模型

3.1 分子信标的设计

分子信标的设计需要根据分子信标识别区在被其互补链杂交时产生的张力和分子信标茎杆的键能设计其茎杆长度。若环状区过短，则很容易和非靶序列结合导致信标分子结构破裂。若茎杆部位很短，则环状识别区会因和其他寡聚核苷酸结合而拉开茎干，茎干很长，则会导致环区结合靶序列后也打不开发卡结构。通常探针序列要比茎杆区序列长两倍以上。因吡啶分子的二臂可以分别与两个鸟嘌呤G形成稳定的三个氢键，可以设计一些鸟嘌呤G-C的非匹配对在分子信标的茎杆部分，定向诱导非匹配对形成杂交分子信标的茎环结构。

影响分子信标的因素还有温度、pH、分子信标的纯度等。分子信标的熔链温度取决于茎杆区长度、G-C含量以及缓冲液离子强度，在较低温度时可保持稳定的发卡结构，在较高温度会破坏稳定的发卡结构而发出荧光。pH过高，茎杆区碱基对之间的稳定结构也会被破坏，使分子信标变性而产生荧光。杂质的存在严重影响分子信标的使用效果，导致检测灵敏度降低，因此在使用分子信标试剂之前要进行严格的纯化。

3.2 模型算法研究

自组装计算模型由Winfree等学者首次提出[3]。自组装计算模型的原理是由DNA序列的相互作用构成特殊形态从而进行计算。DNA自组装实际上是构造DNA分子结构。在操作过程中将把单链DNA人工合成的过程称为DNA杂交。杂交DNA分子具有特殊的粘性末端，因此它易于结合那些一样具有粘性末端的DNA分子，而进一步促进DNA分子组装。

DNA计算模型主要分为三步。

（1）生成给定问题所有可能解。

（2）利用生化反应的并行性，高速删除非解。

（3）检测问题最终解。

发夹DNA计算模型是由Sakatomo等人首次提出。其基本思想是通过合理编码，将错误解编码成可以在计算过程中形成发夹结构，并在每个编码的DNA分子中加入某些内切酶识别位点的碱基，这样就可以在发现错误解后将形成的发夹结构清除。将分子信标作为自组装单元，是因为分子信标在一定条件下能够直接将溶液中的核酸序列信息转化为荧光信息，简化了检测DNA计算的最终解，而且分子信标可精确到单个碱基，大大减弱了与环部序列单个碱基错配时所诱发的荧光信号，提高了结果的准确性。

算法的生物实现步骤如下。

对问题进行抽象并在DNA链上编码分子信标；在实验设施中加入所有约束条件中所包含的双链DNA分子，通过一系列反应产生一个包括大量不同DNA双链的大型数据池；升高实验温度使数据池中的DNA链发生变性反应从而解链成两条单链DNA，然后将溶液稀释，使得单链序列可自身形成发夹结构；通过分子信标产生的荧光判断非解，切割所有形成的发夹结构；加热解链，清洗掉所有杂交的补；退火重新形成分子信标；重复进行步骤3，4，5，6，排除所有的非解；对没有切割水解掉的DNA链进行PCR扩增即可得到最终解。

4 结论与展望

作为一个DNA计算模型，这种方法具有并行的执行过程[4]，低能耗和计算高速性。分子信标灵敏度高，选择性好，无需洗脱，且分子信标对碱基错配分析时错配位点所在位置没有要求，靶序列错配碱基所在位置的改变不影响反应结果，使得探针的设计更为简单，比普通线型核酸探针有更大的灵活性。将分子信标与DNA自组装结合，具有极大的研究价值。当然也有很多的缺点：如不够自动化，发展空间不足，计算速度虽快但是得到结果和数据的速度却很慢。

DNA分子解链温度Tm的高低与其分子大小及所含碱基中G和C所占的比例相关，G和C含量越高值越高，且可由DNA分子大小及其GC含量计算，计算公式为：Tm=69.3+0.41（%G+C），小于20bp的寡核苷酸片断的Tm值可用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）计算。温度对实验结果的影响极其重要，因此寻找实验温度的一致性，有助于提高计算结果的准确性。开发不同的猝灭剂也是提高荧光猝灭效率和检测灵敏度的一个研究方向，如增强荧光基团的信号，使用高效猝灭剂提高猝灭基团对荧光基团的猝灭效率，同时将多个猝灭基团修饰在分子信标上等。

参考文献

[1]Watson J D，Crick F H C.Molecular Structure of Nucleic Acids： A Structure for Deoxyribose[J].Nature，1953，171（25）：737-738.

[2]Tyagi S，Krammer F R.Molecular Beacons：Probes that Fluoresce Upon Hybridization[J].Nat Bioteehnol，1996，14：305-308

[3]Winfree E.Design and self-assembly of two-dimensional crystals.Nature，1998，394：1223-1226.

[4]Ogihara M，Ray A，Executing parallel logical operations with DNA，IEEE，1999.

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