荆花胃康胶丸对幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜核因子κBp65表达的影响

材料

1.1  动物

SPF级KM小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，雄性，共44只，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。

1.2  菌株

Hp SS1菌株由北京大学第一医院消化内科实验室保存并惠赠。

1.3  药物

荆花胃康胶丸挥发油，天士力制药集团股份有限公司，批号20101117;甲硝唑（批号20120228）、克拉霉素片（批号20120704）、兰索拉唑（批号20130205），大连美仑生物技术有限公司;注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号13071225。

1.4  主要试剂与仪器

哥伦比亚血琼脂培养基，梅里埃生物制品有限公司，批号1002666010;脑心脊液粉，OXOID，批号783396;快速尿素酶试剂，北京大学第一医院消化内科实验室;DEPC处理水，Solarbio，批号20120605;RNAlater Solution，Invitrogen，批号1210008;Trizol Reagent，invitrogen，批号1382739;反转录试剂盒，Thermo scientific，货号K1631;SYBR？Green Realtime PCR Master Mix试剂盒，TOYOBO，货号QPK-201;UltraSensitiveTM SP免疫组化试剂盒（货号kit-0305）、DAB显色试剂盒（货号DAB-0031），福州迈新生物技术开发有限公司;一抗为NF-κB兔抗鼠抗体，武汉博士德生物工程有限公司，货号BA0610;实时荧光定量PCR检测系统，Bio-Rad IQ5。

2  实验方法

2.1  幽门螺杆菌培养及菌液制备

将冻存的菌株常温解冻，以加样器反复吹打后吸取100 μL菌液滴加于培养基上，用L型玻璃棒将菌液均匀涂布于培养基表面，置于37 ℃、微需氧（15%CO2、5%O2、80%N2）、饱和湿度条件下培养48～72 h。复苏成功后的菌落经快速尿素酶试验（RUT）、过氧化氢酶试验及镜检进行鉴定后，于上述条件下传代增菌。无菌接种环收集Hp菌落于脑心脊液中，比浊法调整菌悬液浓度为4麦氏浊度，即12×108 CFU/mL。

2.2  分组、造模与给药

SPF级环境饲养KM小鼠44只，随机分为空白组、模型组、荆花胃康组、三联组各11只。适应性饲养3 d，各组予环磷酰胺200 mg/kg腹腔注射1次，第2日起模型组及各药物组给予新鲜Hp菌悬液0.4 mL/只灌胃，隔日1次，共5次。灌胃前禁食24 h，灌胃后禁食水2 h。末次灌胃2周后，每组随机检杀1只小鼠，行RUT、Warthin-Starry染色判断定植情况，阳性者为Hp感染。判定为Hp感染小鼠，参照临床剂量，以标准体质量进行换算[3]。荆花胃康组每日给予荆花胃康挥发油49.32 mg/kg灌胃，连续4周;三联组每日予兰索拉唑12.33 mg/kg、甲硝唑164.40 mg/kg、克拉霉素205.54 mg/kg灌胃，连续1周;另3周每日予灭菌注射用水灌胃;模型组每日给予灭菌注射用水灌胃，连续4周;空白组不予干预。各组小鼠均于开始给药4周后脱颈处死。

2.3  检测指标

2.3.1  光镜观察  小鼠处死后，剖腹取全胃，沿胃大弯剪开，4 ℃ DEPC处理水冲洗胃内容物后，取一半胃组织入多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色。

2.3.2  核因子κB p65基因表达测定  ①总RNA提取及cDNA合成：取另一半胃窦组织投入RNAlater中4 ℃过夜，移去上清，保存于-70 ℃。将冻存标本匀浆，采用Trizol-酚-氯仿抽提法提取总RNA。反转录采用20 μL反应体系：0.1～5 ng总RNA，1 μL Oligo-dT，DEPC处理水补齐12 μL，充分混匀后65 ℃加热5 min后置于冰上待用;每管再加4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTP Mix，1 μL RNase Inhibitor，1 μL Reverse Transcriptase，充分混匀，42 ℃、60 min→70 ℃、10 min，冰上待用。②引物：于GenBank查找小鼠NF-κB p65基因序列（NM_009045.4），引物设计见表1。③实时荧光定量PCR：20 μL反应体系，2×SYBR Green PCR Mix 10 μL， 0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，0.33 μL cDNA模板，9 μL DEPC处理水;扩增条件为95 ℃、15 min， 95 ℃、15 s，61 ℃、60 s，共40个循环，反应完毕后对扩增产物作融解曲线，每个样本重复3次。

2.3.3  核因子κB p65免疫组化测定  石蜡切片脱蜡至水，高压抗原修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS冲洗3×3 min，滴加正常动物非免疫血清室温孵育10 min后，滴加一抗4 ℃过夜，PBS冲洗3×5 min，滴加生物素标记的二抗室温孵育10 min，PBS冲洗3×3 min后，滴加新鲜配制的DAB显色液，阳性显色为棕色或黄色，PBS冲洗，苏木素复染，冲洗后酒精梯度脱水，二甲苯透明封片。采用Image Pro-Plus软件，以平均光密度值表示细胞核、细胞浆中NF-κB p65含量，并计算核/浆比值。

3  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以x（—）±s表示。各样本符合正态分布进行方差分析，多重比较采用LSD法;不符合正态分布进行Kruskal-Wallis H检验;如总体样本差异存在统计学意义，组间多重比较采用Nemenyi检验。检验水准α=0.05。

4  结果

4.1  病理观察结果

各组胃黏膜上皮完整，未见明显糜烂、水肿、溃疡等病理改变，胃体及胃窦部腺体完整，无萎缩及上皮内瘤变。模型组胃黏膜上皮细胞表面可见定植Hp。

4.2  核因子κB p65基因表达水平

通过2-ΔΔCt计算基因相对表达水平，与空白组比较，模型组NF-κB p65 mRNA相对表达量明显减少（P=0.004）;与模型组比较，三联组及荆花胃康组NF-κB p65 mRNA相对表达量明显增加（P<0.001），荆花胃康组较三联组差异有统计学意义（P<0.001）。结果见表2。除空白组外，其余各组均不符合正态分布，Kruskal-Wallis H检验χ2=86.303，P<0.001，样本总体差异有统计学意义。结果见表3。

4.3  核因子κB p65含量

细胞核中NF-κB p65平均光密度总体分布差异有统计学意义（χ2=10.960，P=0.012），细胞浆中平均光密度总体分布差异未见统计学意义（F=1.922， P=0.134），核/浆光密度比值总体分布差异有统计学意义（χ2=14.527，P=0.002），结果见表4。平均核/浆光密度比值组间Nemenyi检验结果见表5。与空白组比较，模型组明显增加（P=0.002）;三联组较模型组降低（P=0.420）;荆花胃康组较模型组差异有统计学意义（P=0.022）;荆花胃康组与空白组比较，差异无统计学意义（P=0.750）。染色结果见图1。

5  讨论

NF-κB是重要的多功能核转录因子，广泛存在于真核细胞内，参与调控多种生理及病理过程。该通路主要由各种炎症刺激激活，如白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子或细菌产物脂多糖等。这些刺激因子可通过细胞内信号传导激活IKK复合体，磷酸化的IKK复合体随后激活IκB，诱发其磷酸化、泛素化和降解，NF-κB的核定位序列暴露，进入核内，与靶基因的κB位点结合，发挥转录活性，介导炎症反应。NF-κB蛋白形成同源或异源二聚体，p65/p50是最早被发现也是存在最广泛的二聚体形式，含有p65的NF-κB二聚体能够激活转录。Hp定植于胃黏膜上，与胃上皮细胞的直接接触就能使胃上皮细胞发生细胞骨架重组和酪氨酸磷酸化，进而激活NF-κB，使上皮细胞分泌IL-8等趋化因子，构成了宿主的第一线防御应答[4]。研究表明，Hp相关性胃炎患者胃黏膜组织活检标本中NF-κB的表达明显上调，且与胃黏膜炎症程度成正相关[5]。NF-κB激活后， IL-1、IL-8、TNF-α等水平增强，其中IL-1和TNF-α可促进NF-κB进一步活化，同时使细胞因子IL-6、IL-8等表达水平增强，产生级联反应，使炎症过程得到放大和持续，因此，NF-κB在致炎中具有中心地位。

荆花胃康胶丸由土荆芥、水团花两味药物组成，功效理气止痛、清热化瘀，临床用于寒热错杂、气滞血瘀所致的慢性胃炎及消化性溃疡，能有效提高临床患者Hp根除率[6]。本研究表明，与模型组比较，荆花胃康胶丸干预后，NF-κB p65蛋白细胞核内的表达水平及核/浆比值显著降低，达到与空白组相同的水平，三联组则较模型组无明显降低;各组间mRNA水平则呈现相反趋势，即药物干预后明显增加。由于蛋白质是结构基因表达的最终产物，在体内真正发挥生物学作用，且蛋白质表达水平不仅取决于基因转录的速率，也与转录物的稳定性、翻译调节以及翻译后的折叠和加工修饰密切相关，因而基因转录的mRNA水平并不能完全代表其相应蛋白质的水平，二者的不一致性并非罕见。既往有研究显示，基因和蛋白水平无论在单个基因还是在整个细胞系中相关系数一般小于0.5，其差别最高可达30倍[7]。因此，NF-κB p65蛋白细胞核水平、核/浆比值水平降低表明荆花胃康胶丸能够有效减少NF-κB p65的入核而干预炎症反应，其可能是通过干预NF-κB信号通路中IKK、IκB等环节而实现的。关于基因和蛋白水平的差异，可能是蛋白水平被抑制后，基因的反馈性增高，抑或是基因翻译及翻译后修饰的过程受到调节，尚需进一步研究以明确。

参考文献：

[1] Liu Wei， Liu Yu， Zhang Xue-zhi， et al. In vitro bactericidal activity of Jinghua Weikang Capsule and its individual herb Chenopodium ambrosioides L. against antibiotic-resistant Helicobacter pylori[J]. Chin J Integr Med，2013，19（1）：54-57.

[2] 朱秀芳，段志英，牛巍巍，等.荆花胃康胶丸联合PPI三联治疗幽门螺杆菌阳性80例[J].中国新药杂志，2012，21（20）：2417-2419.

[3] 黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069-1072.

[4] Go MF， Growe SE. Virulence and pathogenicity of Helicobacter pylori[J]. Gastroenterol Clin North Am，2000，29：649-670.

[5] Doger FK， Meteoglu I， Ozkara E， et al. Expression of NF-kappaB in Helicobacter pylori infection[J]. Dig Dis Sci，2006，51（12）：2306-2309.

[6] 王婷婷，张月苗，张学智，等.荆花胃康胶丸联合PPI三联疗法治疗幽门螺杆菌阳性慢性萎缩性胃炎效果观察——多中心随机对照临床研究[J].中华医学杂志，2013，93（44）：3491-3495.

[7] 潘佳忻，张志文.翻译调控-联系基因组学和蛋白质组学的有效手段[J].生物学通报，2003，38（3）：18-19.

（收稿日期：2014-04-10;编辑：华强）

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