东北铁线莲不同提取部位的抗炎镇痛作用研究

摘要 目的：研究和比较东北铁线莲不同提取部位的抗炎镇痛活性。方法：东北铁线莲经提取、萃取、浓缩得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，实验分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，分别利用小鼠醋酸扭体疼痛模型和脂多糖诱导RAW264.7细胞炎性反应模型评估4个提取部位的镇痛活性和抗炎活性。结果：在镇痛实验中，乙酸乙酯部位对小鼠扭体的抑制率最高；抗炎实验结果显示，乙酸乙酯部位抑制NO的效果最为显著。结论：东北铁线莲不同部位的抗炎镇痛效果不同，其中乙酸乙酯部位抗炎镇痛活性最强。

关键词 东北铁线莲；提取部位；抗炎；镇痛

Abstract Objective：To study the anti-inflammatory and analgesic activities of different fractions extracted from Clematis manshurica Rupr.Methods：The parts of petroleum ether，chloroform，ethyl acetate and n-butanol were obtained by abstracting，extracting and concentrating.The experiment was divided into three groups：negative control group，positive control group and experimental group.In the study，mouse acetic acid writhing and lipopolysaccharide （LPS） induced RAW264.7 cell model were used to evaluate analgesic and anti-inflammatory activity of the four fractions.Results：In the experiment of analgesic，the inhibition rate of writhing was the most significant in the ethyl acetate fraction.The results of anti-inflammatory experiment suggested that the ethyl acetate fraction showed significant inhibitory effect on nitric oxide （NO）.Conclusion：The anti-inflammatory and analgesic effects of different parts of Clematis mandshurica were different，and ethyl acetate fraction showed the most significant anti-inflammatory and analgesic activity.

Key Words Clematis manshurica Rupr； Extract； Anti-inflammation； Analgesia

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.047

东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr.）是毛茛科铁线莲属植物，其根及根茎可作为中药威灵仙入药，具有通络止痛、祛风湿之功效，在临床上主要用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利等症。随着现代药理学和临床医学研究的不断深入，东北铁线莲更是显示出抗肿瘤、解痉、抗氧化、抗炎镇痛等诸多药理活性[1]。研究[2-3]发现，东北铁线莲的醇提取物和根部提取物可以通过抑制LPS/IFN-γ诱导的巨噬细胞中NO和PGE2的产生发挥抗炎作用。刘光耀等[4]以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7细胞为炎性反应模型研究威灵仙不同提取部位的抗炎作用，结果显示活性强弱依次为威灵仙乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位和水部位。但是东北铁线莲中各提取部位的抗炎镇痛作用是否有差异及对巨噬细胞分泌炎性反应因子的干预作用研究鲜有文献报道。本研究采用小鼠醋酸扭体疼痛模型和LPS诱导RAW264.7细胞炎性反应模型分别研究东北铁线莲不同提取部位的镇痛和抗炎作用，明确东北铁线莲抗炎镇痛的活性部位，为其临床应用提供理论依据。

材料与方法

1. 材料

1.1. 动物与细胞 无特定病原体（SPF）级健康ICR小鼠320只，雌雄各半，体重20～25 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016；实验动物合格证号2008001663805]，在上海市第六人民医院实验动物中心[动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0020]适应性饲养3 d，动物自由摄水，室温控制在23～25 ℃，相对湿度为50%～70%，每天光照10 h～12 h。RAW264.7细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 药物 东北铁线莲购于上海虹桥中药饮片有限公司（批号：160307），经鉴定为毛莨科铁线莲属东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr.）的干燥根茎；冰醋酸（批号：20160308，台山市新宁制药有限公司）；阿司匹林肠溶片（批号：BJ28761，拜耳医药保健有限公司）。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM（Dulbecco minimum essential medium）培养基（批号：319006013，维森特生物科技有限公司）；磷酸缓冲盐溶液（PBS）（批号：171860，Biosharp公司）；胎牛血清（FBS）（批号：20170710，杭州四季青生物工程材料有限公司）；脂多糖（LPS）（批号：017M4112V，Sigma公司）；MTT（批号：303H0528，索莱宝Solarbio公司）；NO检测试剂盒（批号：20170919，南京建成生物工程研究所有限公司）。二甲苯（分析纯），上海江莱生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO，分析纯），国药集团化学试剂有限公司；其他化学试剂乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等均为分析纯，购于上海凌峰化学试剂有限公司。N-1100D型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）；SB-2000型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；KQ5200DB型數控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9147A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SL2001N型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；CKX31SF型倒置显微镜（Olympus公司）；SIMPLICITY型超纯水系统（Millipore公司）；微量加样器（Eppendorf公司）；TDL-80-2B型低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；ALLEGRAX-22R型高速离心机（Beckman公司）；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；Epoch型酶标仪（BioTek公司）。

1.2 方法

1.2. 东北铁线莲提取 取48 kg东北铁线莲用75%乙醇料液比1∶10浸泡16 h，80 ℃提取1次，3 h；再用75%乙醇料液比1∶8，80 ℃提取2次，每次2 h。合并3次提取液，过滤浓缩至31L。浓缩液去沉淀后，用石油醚1∶1萃取3次，合并石油醚层；水层用氯仿1∶1萃取3次，合并氯仿层；水层用乙酸乙酯1∶1萃取3次，合并乙酸乙酯层；水层用正丁醇1∶1萃取3次，合并正丁醇层。4种萃取液分别浓缩至干，得到东北铁线莲石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位。

1.2.2 动物分组与给药方法

1.2.2. 药液及工作液的配制 阴性对照组药液：0.5%CMC-Na；阳性对照组药液：用0.5%CMC-Na配制阿司匹林至终浓度20 mg/mL；实验工作液：用0.5%CMC-Na配制石油醚部位0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL，氯仿部位0.55 mg/mL、1. mg/mL、2.2 mg/mL，乙酸乙酯部位1.75 mg/mL、3.5 mg/mL、7 mg/mL，正丁醇部位8 mg/mL、16 mg/mL、32 mg/mL。

1.2.2.2 小鼠醋酸扭体实验 采用小鼠醋酸扭体模型筛选威灵仙中具有镇痛活性的有效部位。将小鼠分为模型组、阳性对照组和给药组（4种浸膏），且给药组分别设高、中、低剂量组，每组10只，给药1周后，小鼠腹腔注射1.2%醋酸溶液0.2 mL/10 g，记录每只小鼠15 min内扭体次数，计算扭体抑制率。并將4个部位低中高剂量对小鼠扭体抑制率制图，比较其镇痛活性强弱。

扭体抑制率（%）=（阴性对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/阴性对照组平均扭体次数×100%

1.2.3 细胞培养与给药方法

1.2.3. 工作液的配制 石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4个部位分别加DMSO配制浓度为2 mg/mL母液，-20 ℃保存，实验时用10%FBS培养基将石油醚部位稀释成100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL；将氯仿部位西施至50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL、 μg/mL；将乙酸乙酯部位稀释至100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL；将正丁醇稀释至200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL（保证细胞毒性不能过大）。LPS加PBS配制浓度为1.25 mg/mL母液，-20 ℃保存，实验时用10%FBS培养基稀释成100 μg/mL模型工作液。

1.2.3.2 RAW264.7细胞培养 RAW264.7细胞在37 ℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液传代培养。

1.2.3.3 RAW264.7细胞活力检测 RAW264.7细胞按3×104/孔接种于96孔板中，培养箱中培养12 h后吸去原培养基，更换2%FBS培养基饥饿12 h。饥饿后，实验组每孔分别加入不同浓度的实验工作液100 μL；阴性对照组和模型组均加入10%FBS培养基100 μL（均设3个复孔）。培养 h后，模型组和实验组每孔加入LPS工作液 μL（此时LPS浓度为 μg/mL），继续培养36 h。36 h后吸取上层培养液至离心管，每孔加入新鲜培养液100 μL，再加入新配制的5 mg/mL MTT液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，置摇床上低速振荡10 min后，用酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度值（OD490 nm）。

细胞活力=（药物孔OD值-调零孔OD值）/（阴性对照孔OD值-调零孔OD值）×100%

1.2.3.4 NO含量测定 收集至离心管的上层培养液，4 000 r/min离心5 min，取上清。采用NO检测试剂盒测定上清中NO含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 小鼠醋酸扭体法模型采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用因素方差分析。RAW264.7细胞抗炎模型采用GraphPad5.02软件绘图，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 东北铁线莲不同部位的镇痛活性 利用小鼠醋酸扭体疼痛模型对东北铁线莲不同部位的镇痛活性进行筛选，发现乙酸乙酯部位中剂量的小鼠扭体抑制率最高，高达61.91%。见表1、表2。同时发现乙酸乙酯部位镇痛活性最强。见图1。

2.2 东北铁线莲不同部位的抗炎活性 采用RAW264.7细胞炎性反应模型检测东北铁线莲不同部位的抗炎活性，乙酸乙酯部位浓度高达100 μg/mL时出现较弱的细胞毒性；正丁醇部位10 μg/mL也具有较弱的细胞毒性。见图2。NO抑制实验结果显示氯仿、乙酸乙酯部位的抗炎效果较明显，其中乙酸乙酯部位对NO的抑制呈浓度依赖性，且浓度为60 μg/mL时抗炎效果最好。见图3。

3 讨论

炎性反应发生时机体组织会分泌许多抗炎因子来保护组织免受损伤，当持续过量产生促炎因子会使调节网络失衡，进而诱发炎性反应的级联反应。威灵仙作为传统的中药，近年来研究发现其具有显著的抗炎镇痛作用，但是对于东北铁线莲的抗炎镇痛作用研究和不同提取部位间作用的差异性鲜有文献报道，仅有学者研究证明了东北铁线莲的醇提取物[2]、根部提取物[3]和少数单体[5-8]可以通过抑制炎性反应因子的产生发挥抗炎作用。因此，本研究采用LPS刺激的RAW264.7细胞炎性反应模型和小鼠醋酸扭体反应模型，比较东北铁线莲不同提取部位的抗炎镇痛活性差异。实验发现东北铁线莲石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能不同程度抑制RAW264.7细胞分泌产生NO和醋酸诱导小鼠扭体次数，且乙酸乙酯部位抗炎镇痛活性最强。

小鼠腹腔注射醋酸后能够引起行为学改变即发生扭体反应，这一模型是实验中常用的与疼痛相关的模型，如有学者利用此模型研究了胆碱和对乙酰氨基酚的协同镇痛作用及其机制[9]，另有学者利用此模型进行了中药提取物的抗炎镇痛作用研究[10]。本文研究了东北铁线莲不同提取部位对小鼠扭体次数的抑制率，进而比较其镇痛作用的强弱。

LPS刺激RAW264.7细胞炎性反应模型是研究炎性反应的经典模型，有多位国内外学者利用这一模型进行炎性反应研究[2，7，11]。NO是由一氧化氮合酶催化合成的气体分子，具有介导炎性反应的功能，LPS刺激与炎性反应有关的一氧化氮合酶的表达，促使NO水平升高[12]。因此抑制机体NO的产生是治疗炎性反应的重要手段。本实验结果表明，RAW264.7细胞经LPS刺激后NO含量明显增加，用东北铁线莲不同部位处理后，NO的产生受到了明显的抑制，且乙酸乙酯部位抑制作用最显著。

综上所述，东北铁线莲具有潜在的抗炎镇痛药理作用，其不同提取部位均能抑制醋酸诱导小鼠的扭体反应和LPS诱导RAW264.7的NO分泌，并且乙酸乙酯部位效果最为显著。目前的研究初步证实，抑制炎性反应因子的产生是东北铁线莲不同提取部位发挥抗炎镇痛作用的机制之一，且乙酸乙酯部位的抗炎镇痛作用最强，但是发挥抗炎镇痛作用的具体成分和作用机制有待进一步研究。

参考文献

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[6]Dilshara MG，Lee KT，Lee CM，et al.New compound，5-O-isoferuloyl-2-deoxy-D-ribono-γ-lacton from Clematis mandshurica：Anti-inflammatory effects in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].IntImmunopharmacol，2015，24（1）：14-23.

[7]Lee CW，Park SM，Zhao R，et al.Hederagenin，a major component of Clematis mandshurica Ruprecht root，attenuates inflammatory responses in RAW 264.7 cells and in mice[J].Int Immunopharmacol，2015，29（2）：528-537.

[8]Dilshara MG，Lee KT，Jayasooriya RG，et al.Dowegulation of NO and PGE2 in LPS-stimulated BV2 microglial cells by trans-isoferulic acid via suppression of PI3K/Akt-dependent NF-κB and activation of Nrf2-mediated HO-1[J].IntImmunopharmacol，2014，18（1）：203-211.

[9]张卫东，郭梦倬，张娜，等.胆碱和对乙酰氨基酚的协同镇痛作用及其机制[J].药学学报，2017，8（52）：1262-1267.

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