Genistein对雌性大鼠卵巢颗粒细胞FSHR基因表达的影响

对照组比较，10 μmol/L Genistein组FSHR mRNA表达显著增加（P < 0.05）。ICI 182，780（1 μmol/L）预处理细胞30 min后加入1和10 μmol/L Genistein，其FSHR mRNA表达分别较1和10 μmol/L Genistein组显著下降（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 10 μmol/L的Genistein可上调雌性大鼠卵巢颗粒细胞中FSHR表达，且该作用可能是通过ER介导的。

[关键词] Genistein;雌性大鼠;卵巢颗粒细胞;卵泡刺激素受体

[中图分类号] R966          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（b）-0016-03

[Abstract] Objective To observe the effect of Genistein on the expression of follicle stimulating hormone receptor （FSHR） gene in ovarian granulosa cells of female rats and its relationship with estrogen receptor （ER）. Methods Female rats aged 25-28 days were subcutaneously injected with pregnant mare serum gonadotrophin to establish follicular development model. Ovarian granulosa cells were isolated and cultured. Genistein （0， 0.1， 1，5， 10， 100 μmol/L） and estrogen receptor blocker ICI 182，780 （1 μmol/L） were treated for 24 hours respectively. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the expression of FSHR mRNA， an upstream regulator of aromatase gene. Results Compared with the blank control group， the expression of FSHR mRNA was significantly increased in the 10 μmol/L Genistein group （P < 0.05）. After ICI 182，780 （1 μmol/L） pretreatment for 30 minutes， the expression of FSHR in ICI 182，780 pretreated cells with 1 and 10 μmol/L Genistein was significantly lower than that in the 1 and 10 μmol/L Genistein groups （P < 0.05 or P < 0.01） respectively. Conclusion 10 μmol/L of Genistein can up-regulate the expression of FSHR in ovarian granulosa cells of female rats， and this effect may be mediated by ER.

[Key words] Genistein; Female rat; Ovarian granulosa cells; Follicle stimulating hormone receptor

Genistein（也称染料木黄酮）是植物雌激素大豆异黄酮的主要活性成分，具有强抗氧化性和多重肿瘤抑制效应[1-3]，能双向调节雌激素受体[4-6]。研究[7]发现，Genistein可通过性腺外途径诱导芳香化酶基因（CYP19）转录，增加局部雌激素合成，对绝经期后雌激素来源可能有重要意义。在卵巢颗粒细胞，CYP19活性主要受卵泡刺激素（FSH）调节[8]，后者通过FSHR-AC-cAMP-PKA途径，激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB），进而始动芳香化酶基因转录[9-10]。前期研究[11]发现，一定剂量的Genistein可影响卵巢芳香化酶基因表达，但FSHR是否参与其中，作用是否通过雌激素受体介导，目前尚不清楚。

本研究采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），初步探讨Genistein对雌性大鼠卵巢中颗粒细胞FSHR基因表达的影响，并利用雌激素受体阻断剂ICI 182，780进一步观察Genistein上述作用与雌激素受体的关系，初步揭示Genistein对卵巢局部雌激素分泌功能影响的分子机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

25～28日龄健康雌性SD大鼠，体重60～80 g，由哈医大附属二院实验动物中心提供。实验动物的使用许可证号为（黑）2013-002。

1.2 主要儀器及试剂

PCR扩增仪（PTC-100型，美国MJ.Research）;GIS凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。Genistein、17β-雌二醇（17β-E2）及ICI 182，780（美国Sigma）;Trizol（美国Invitrogen）;BcaBESTTM RNA PCR Kit（大连Takara）;引物（上海英骏生物公司合成）。

1.3 细胞培养

于实验大鼠颈部皮下注射孕马血清促性腺激素（PMSG，60 U/只），48 h后急性断头处死，立刻剥离出双侧卵巢，小号针头反复刺破卵泡并反复吹打，充分释放出颗粒细胞，200 μm滤网去除多余残渣后，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗，1100 r/min离心5 min，弃上清液。向细胞沉淀中加入2 mL新鲜配制的DMEM/F12培养液（含青、链霉素），混匀，调整细胞浓度至（3×105～5×105）/mL。将细胞悬液分装至6孔培养板上，置于37℃的5%CO2培养箱中孵育。细胞培养48 h后，加入一定浓度Genistein、17β-E2及ICI 182，780处理。

1.4 细胞分组及处理

实验共分9组：0 μmol/L Genistein组（空白对照组，A组）;10 nmol/L 17β-E2组（B组）;0.1 μmol/L Genistein组（C组）;1 μmol/L Genistein组（D组）;5 μmol/L Genistein组（E组）;10 μmol/L Genistein组（F组）;100 μmol/L Genistein组（G组）;1 μmol/L ICI预处理30 min后加1 μmol/L Genistein组（H组）;1 μmol/L ICI 182，780预处理30 min后加10 μmol/L Genistein组（I组）。上述因素继续处理细胞24 h后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，-70℃保存，用于总RNA提取和RT-PCR。上述实验共重复3次。

1.5 检测指标及方法

采用RT-PCR法检测FSHR基因mRNA表达。采用Trizol提取细胞总RNA，逆转录按BcaBESTTM RNA PCR Kit说明书操作。通过Gene Runner软件设计引物，以β-actin作为内参。引物的序列和产物长度见表1。PCR反应的扩增条件为94℃预变性1 min，94℃变性4 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环次数为35次，72℃充分延伸10 min。产物于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统扫描后进行条带灰度分析，以FSHR基因与β-actin灰度比值代表前者相对表达量。实验重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠卵巢中颗粒细胞FSHR mRNA的表达情况

RT-PCR电泳结果显示，各组细胞均扩增出一条清晰的、大小约为481 bp的FSHR特异片段。见图1。

2.2 Genistein对颗粒细胞FSHR mRNA表达的影响

扫描的条带分析结果显示，与空白对照（A组）比较，10 μmol/L Genistein组（F组）FSHR mRNA表达明显增加（P < 0.05），10 nmol/L 17β-E2组（B组）FSHR mRNA表达降低（P < 0.05），100 μmol/L Genistein组（G组）FSHR mRNA表达也明显降低（P < 0.01）。用ICI 182，780（1 μmol/L）预先处理细胞30 min后，分别加1 μmol/L Genistein（H组）和10 μmol/L Genistein（I组）继续处理细胞24 h，发现H组FSHR mRNA表达较D组明显降低（P < 0.05），I组FSHR mRNA表达较F组明显降低（P < 0.01）。见图2。

3 讨论

近年研究证实，植物雌激素Genistein可增加女性卵巢癌细胞对常规性化疗药物的敏感性[10]，调节女性内分泌活动，改善围绝经期综合征临床症状[12-14]。前期在体实验[15-17]也发现，Genistein上调雌性衰老大鼠的ER-α表达，并促进雌激素生成关键酶芳香化酶基因表达，但具体的分子机制尚不十分清楚。

Genistein可调节男性生殖系统FSHR表达[18]，并且Genistein能通过激活PKC和p38而促使DNA结合FSHR下游因子CREB，并促进芳香化酶基因CYP转录[19-20]。本研究观察了Genistein对雌性大鼠卵巢中颗粒细胞FSHR mRNA表达的影响，结果发现10 μmol/L Genistein作用细胞24 h，可增加FSHR mRNA的表达（P < 0.05），并且ER阻断剂ICI 182，780可明显抑制1 μmol/L和10 μmol/L Genistein对FSHR 基因表达的上调作用（P < 0.05或P < 0.01），提示Genistein对FSHR表达的这种促进作用可能与调节ER有关[21]。

Genistein对子宫内膜CYP19的启动子Ⅰ的影响可能通过一种新型膜性ER（G蛋白偶联雌激素受体，GPER）介导[22]。然而，GPER是否也介导了Genistein对卵巢CYP19及上游FSHR表达的影响，还有待进一步研究。

[参考文献]

[1]  Chen MN，Lin CC，Liu CF. Efficacy of phytoestrogens for menopausal symptoms：a meta-analysis and systematic review [J]. Climacteric，2015，18（2）：260-269.

[2]  Setchell KDR. The history and basic science development of soy isoflavones [J]. Menopause，2017，24（12）：1338-1350.

[3]  Takagi A，Kano M，Kaga C. Possibility of breast cancer prevention：use of soy isoflavones and fermented soy beverage produced using probiotics [J]. Int J Mol Sci，2015，6（5）：10 907-10 920.

[4]  Varinska L，Gal P，Mojzisova G，et al. Soy and breast cancer：focus on angiogenesis [J]. Int J Mol Sci，2015， 16（5）：11 728-11 749.

[5]  Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al. Genistein and cancer：current status， challenges， and future directions [J]. Adv Nutr，2015，6（4）：408-419.

[6]  Siow RC，Mann GE. Dietary isoflavones and vascular protection：activation of cellular antioxidant defenses by SERMs or hormesis [J]. Mol Aspects Med，2010，31（6）：468-477.

[7]  Ye L，Chan MY，Leung LK. The soy isoflavone genistein induces estrogen synthesis in an extragonadal pathway [J]. Mol Cell Endocrinol，2009，302（1）：73-80.

[8]  Casarini L，Moriondo V，Marino M，et al. FSHR polymorphism p.N680S mediates different responses to FSH in vitro [J]. Mol Cell Endocrinol，2014，393（1/2）：83-91.

[9]  Ghosh S，Lu Y，Hu Y. A Role of CREB in BRCA1 Constitutive Promoter Activity and Aromatase Basal Expression [J]. Int J Biomed Sci，2008，4（4）：260-265.

[10]  Samarajeewa NU，Docanto MM，Simpson ER，et al. CREB-regulated transcription co-activator family stimulates promoter Ⅱ-driven aromatase expression in preadipocytes [J]. Horm Cance，2013，4（4）：233-241.

[11]  溫海霞，孟毅，杨永斌，等.Genistein对大鼠卵巢颗粒细胞CYP19表达的影响[J].中国医药导报，2016，13（35）：20-23.

[12]  Solomon LA，Ali S，Banerjee S，et al. Sensitization of ovarian cancer cells to cisplatin by genistein：the role of NF-kappaB [J]. J Ovarian Res，2008，1（1）：9-15.

[13]  李超，刘艾林，杜冠华.天然异黄酮类化合物的药理学研究进展[J].中国新药杂志，2013，22（12）：1415-1420.

[14]  Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al. Genistein and cancer： current status， challenges，and future directions [J]. Adv Nutr，2015，6（4）：408-419.

[15]  肖晓辉，赵薇，刘国艺，等.大豆异黄酮对衰老大鼠卵巢芳香化酶表达的影响[J].生理学报，2006，58（supple 1）：178.

[16]  张翼鸿，庞海燕，肖晓辉，等.大豆异黄酮及其主要活性成分genistein对大鼠卵巢雌激素受体α表达的影响[J].中华医学杂志，2011，91（28）：1987-1991.

[17]  庞海燕，孟毅，赵薇，等.大豆异黄酮及主要活性成分Genistein对大鼠卵巢LRH-1基因表达的影响[J].国际遗传学杂志，2012，35（3）：151-156.

[18]  Yin D，Zhu Y，Liu L，et al. Potential detrimental effect of soy isoflavones on testis sertoli cells [J]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2014，39（6）：598-604.

[19]  Xi YD，Zhang DD，Ding J，et al. Genistein Inhibits Aβ25-35-Induced Synaptic Toxicity and Regulates CaMKII/CREB Pathway in SH-SY5Y Cells [J]. Cell Mol Neurobiol，2016，36（7）：1151-1159.

[20]  Zhou Y，Xu JN，Zeng C，et al. Metformin Suppresses Prostaglandin E2-Induced Cytochrome P450 Aromatase Gene Expression and Activity via Stimulation of AMP-Activated Protein Kinase in Human Endometriotic Stromal Cells [J]. Reprod Sci，2015，22（9）：1162-1170.

[21]  匡野，庞海燕，肖晓辉，等.大豆异黄酮对围绝经期大鼠卵巢FSHR表达的影响[J].中国中医药科技，2011，18（4）：311-312，314.

[22]  Smith HO，Arias-Pulido H，Kuo DY，et al. GPR30 predicts poor survival for ovarian cancer [J]. Gynecol Oncol，2009，114（3）：465-471.

（收稿日期：2018-09-29  本文编辑：王   蕾）

推荐访问： 雌性 卵巢 颗粒 基因 大鼠

---