超高压高效液相色谱法测定茶酒中茶氨酸含量

材料与方法

1.1材料

供试茶酒，市售。Agilent 1290 超高压液相色谱仪，美国安捷伦公司；数显恒温水浴锅，常州市顶新实验仪器有限公司；分析天平，北京科仪仪器有限公司。

茶氨酸标准品（纯度>99%），坛墨质检标准物质中心；邻苯二甲醛（OPA）、

硼酸盐溶液，

美国安捷伦公司；甲醇、乙腈，色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司；磷酸氢二钠，重庆市华东化工有限公司。所用试剂除注明外均为分析纯或优级纯，试验用水均为超纯水（电阻率≥18.3MΩ·cm）。

1.2样品的处理

1.2.1标准溶液的配制。

准确称取一定质量的茶氨酸标准品于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解配制成浓度为1.00 mg/mL的标准储备液，该溶液可在4 ℃的条件下存放3个月。试验测定时移取不同体积的上述储备液于容量瓶中，用超纯水稀释定容配制成相应梯度的标准溶液。

1.2.2样品的前处理。

准确称取5.0 g（精确到0.001 g）茶酒样品于比色管，加水稀释至5 mL。于70 ℃恒温水浴锅中水浴30 min，冷却至室温，过0.45 μm的水系滤膜，待进样分析。

1.3色谱条件

色谱柱：Eclipse AAA C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相A：40 mmol/mL Na2HPO4 溶液（用NaOH 溶液调pH至7.8）；流动相B：ACN∶MeOH∶H2O（45∶45∶10，V/V/V）；流速0.5 mL/ min；柱温35 ℃；检测波长338 nm。流动相随时间的变化进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表1。

1.4柱前衍生

Agilent 1290的自动进样器可以进行程序进样，柱前衍生的过程可以在自动进样器中进行，具体程序如表2所示。

2结果与分析

2.1色谱柱的选择

由于茶氨酸的极性较强[13-15]，依据反相色谱分离原理，化合物的保留时间取决于固定相碳的数目。通过对不同C18柱在超高压下的试验，发现普通的C18柱在超高压下容易出现疏水塌陷，杂质干扰大，响应值较弱，而Eclipse AAA C18柱能较好地分离杂质，保留能力也较强。因此选择Eclipse AAA C18柱进行试验。

2.2检测波长的选择

取某浓度的标准溶液进行衍生后进样，在190～610 nm波长范围内进行茶氨酸衍生物的紫外吸收扫描。从测得的光谱图可以发现，其衍生物的最大吸收波长在335～345 nm，通过多波长的设定及对标准溶液和样品的测定，结合杂质的干扰和衍生物响应值的考量，最终选择338 nm作为最佳的检测波长。标准溶液色谱图见图1所示。

2.3线性关系及检出限

配制不同浓度的茶氨酸标准溶液，再在最佳的色谱条件进行测定，以标准溶液浓度X（μg/mL）为横坐标，以色谱峰的峰面积Y为纵坐标进行线性回归分析，结果显示：线性方程Y=53.57X-41.664，相关系数r为0.999 59，线性范围为0.1～100.0 μg/mL，浓度和峰面积呈现出良好的线性关系，方法的最低检出限为0.05 μg/g（以S/N=3计）。相关数据如图2所示。

2.4精密度及方法稳定性

取一定浓度的茶氨酸标准溶液在同一天内进行6次测定，测得的峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.9%。取衍生前样品和衍生样品各2份，分别放置0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 h后进行测定，通过对测定峰面积数据的处理得出其相对标准偏差为1.1%。上述2个试验说明方法的精密度较佳，衍生前和衍生后样品在一定时间内性质较稳定。

2.5样品测定结果及回收率

采用标准加入法进行回收率试验，分别在空白溶液和待测样品中加入不同浓度的标准溶液，按照样品处理方法进行处理后上机测定，对测定数据进行整理后如表3所示。从表3可以看出，样品的茶氨酸含量为0.25 mg/kg，加标试验的回收率在99.6%～100.1%，满足普通实验室对茶氨酸分析的要求。

3结论

该试验采用超高压高效液相色谱对茶酒中茶氨酸的含量进行了分析研究，利用OPA衍生剂增加了茶氨酸的紫外吸收效果，超高压高效液相色谱对目标物的保留时间、响应灵敏度都有较大地提升。该方法快速、简单、定量准确，易于在茶氨酸的测定分析中推广应用。

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