液相芯片在前列腺癌中的应用

【摘要】液相芯片技术是一种生物检测技术，可对临床大多数生物分子进行高通量分析，如核酸、蛋白质等生物分子。该技术利用了发展成熟的流式细胞术检测原理,以混悬在液相中的分类编码微球为反应及信号检测载体。目前已广泛应用于研究和临床检测中。本文就液相芯片技术的技术原理、特点以及临床应用，尤其是在前列腺肿瘤中的临床应用进行简要介绍。

【关键词】液相芯片技术；原理；前列腺肿瘤

液相芯片(liquid chip)又称悬浮芯片(suspension array),是大规模测定核酸、蛋白质等生物分子的新一代生物芯片技术,以带编码的微球体为载体,以流式细胞技术为检测平台。该技术由20世纪70年代美国Luminex公司研制，最早于1977年由Horan等报道应用于免疫学检测，现今已广泛应用于多个领域，如：免疫分析、酶学分析、核酸研究、抗体筛选及受体与配体的识别分析等。本文就液相芯片技术的原理、特点及在疾病诊断、病原体检测等领域的临床应用作一综述。

1液相芯片技术的基本原理

液相芯片技术的核心是乳胶微球包被、荧光编码和液相分子杂交，其在国际上被称为xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling)技术。液相芯片体系的基质是悬浮于液相体系的聚苯乙烯微球(beads)，根据研究目的不同，可在每种微球上标定特定的抗体或受体探针，从而同时检测同一样品中多个不同的分子。微球表面经一系列修饰后，可达到固定各种蛋白、多肽或核酸等生物分子的目的。液相蛋白芯片技术和液相基因芯片技术可分别用于研究蛋白功能、核酸功能及其相互作用。液相蛋白芯片体系主要由四种成分组成，包括微球、蛋白探针分子、被检测物以及报告分子。在液相系统中，用于标记探针的每一种微球都有其独特的色彩编码，目的就是为了区别不同的探针。色彩编码的原理是：将不同比例的红色分类荧光及发色剂掺入到微球中，产生100种不同颜色的微球，从而标记100种探针分子，可对同一样品中高达100种不同的目标分子同时进行检测。在反应期间，目标分子分别与探针和报告分子进行特异性结合。待特异性结合反应结束后，让单个微球通过检测通道，利用红、绿双色激光，同时检测微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光，从而确定所结合检测物的种类和数量。

2液相芯片技术的特点

液相芯片通过流式检测与芯片技术有机结合，使生物芯片由原来的液相-固相反应体系转变为完全液相反应体系，而完全液相反应体系更接近生物系统内部环境。液相芯片技术平台灵活、开放，具备下面四大特点。

2.1高通量液相芯片能对同一样品中的多种不同目标分子同时进行检测，实施定性和定量分析。

2.2灵敏度高、特异性强、重复性好聚苯乙烯微球的表面积大,单个微球结合的目标分子可多达(1～2)×106个,探针的密度和荧光信号强度高；两束激光可分别对微球分类荧光(特异性)和报告荧光(敏感性)同时进行检测,只有当分类荧光和报告荧光信号同时出现时才会被检测记录,且信噪比高,只要极少量的样品就可进行检测。通过在微球表面进行特异性的化学处理,可使反应选择性得以提高,从而使特异性得到进一步提高［1,2］。

2.3灵活性好、耗时短液相芯片技术既可对核酸进行检测分析，又可对蛋白进行检测分析；只需35～60 min就可检测分析96个不同样本［3］。

2.4操作简单、经济,方便临床应用液相芯片技术减少了洗脱步骤，操作更省时、省力,可用极少量的样品同时对多种成分进行检测,方便临床采样分析；因使用试剂量极少,大大节约了成本；为避免出现各种误差或差错，可将内标物加入到每个反应管中［4,5］。

3液相蛋白芯片的临床应用

3.1抗原抗体定量定性的检测Yan等［6］报道，应用微球免疫检测方法对流感病毒进行检测和分型,结果表明，微球免疫检测方法对流感病毒粒子和重组血凝素抗原的检测敏感性比ELISA方法提高了10倍。Biagini等［7］报道，应用液相蛋白芯片方法可对血清中23种血清型的肺炎球菌荚膜多糖抗体同时进行检测。Wong等［8］报道，应用微球免疫方法能快速检测到西尼罗病毒(West Nile virus),而且可以通过flavivirus免疫，将西尼罗病毒感染与登革热病毒感染、圣路易斯脑炎(St.Lousis encephalitis)病毒感染相鉴别。

3.2细胞因子的检测Gorelik等［9］为研究细胞因子的浓度水平与卵巢癌早期诊断之间的关系,使用液相芯片技术对人体中24种细胞因子的浓度水平进行检测。结果表明,卵巢癌早期患者血样中白细胞介素IL26、IL28以及CA125等6种标记物的浓度水平与健康人比较，差异有统计学意义,早期卵巢癌可通过采用液相蛋白芯片检测上述标记物的浓度变化来进行诊断。Johannisson等［10］首次报道采用液相蛋白芯片技术对动物体内细胞进行检测，结果显示，采用液相蛋白芯片技术方法检测猪促炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)的灵敏度可达0.18～12 ng/ml。

3.3多肿瘤标志物的联合检测前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在男性恶性肿瘤中位居第2位。因此，寻找高敏感性和高特异性的肿瘤标志物(tumor marker，TM)是广大医务工作者所关注的目标。目前发现的肿瘤标志物多为单指标肿瘤标志物，在临床应用中都有其不足之处。而蛋白芯片技术是多指标检测肿瘤标志物的一种新技术，为近些年来发展起来的一项新技术。蛋白芯片技术的原理是将蛋白固定在合适的载体上，以抗原、抗体产生特异性结合，从而达到检测肿瘤标志物的目的。有学者对多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统能提高前列腺癌的检出率进行研究。发现前列腺癌和良性前列腺疾病患者的前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(bPSA)、铁蛋白等水平均升高，但两组增高幅度比较，前列腺癌组明显高于良性前列腺疾病组。前列腺癌的PSA阳性率为73%，bPSA为78%，若使用多肿瘤标志物C12检测系统进行检测，阳性率能提高至80%［11］。

4前景展望

目前,液相基因芯片技术的开发较为成熟,应用也比较广泛，在科学研究和临床应用中,表现出明显的优势。另外,液相蛋白芯片技术的进展也具有广阔的前景。蛋白芯片更接近药物的研发,与疾病的临床检测和诊断也很贴近,未来的“核酸+蛋白”检测方法将对患者提供更为确切的治疗方案［12］。而且,因液相蛋白质芯片技术具备很大优势，如特异性高、亲和力强、受其他杂质影响小、可简化样品的前处理、对生物样品的要求低,以及能直接利用生物材料(诸如血样、尿样、细胞及组织之类)进行检测等等,势必在以后的蛋白质科研和泌尿系肿瘤的诊断与药物研发方面发挥重要作用。

参考文献

［1］Hirama M,Takahashi F,Takahashi K,et al.Osteopontin over-produced by tumor cells acts as a potent angiogenic factor contributing to tumor growth.Cancer Lett,2003,198(1):107-117.

［2］Yang L，Tran DK，Wang X．BADGE，Beads Array for the Detection of Gene Expression，a high-throughput diagnostic bioassay．Genome Res,2001，11(11)：1888-1898.

［3］Fuhon RJ，McDade RL,Smith PL，et al．Advanced multiplexed analysis with the Flow Metrix system．Clin Chem，1997，43(9):1749-1756．

［4］Geissinger E,Weisser C,Fischer P,et al.Autocrine stimulation by osteopontin cont ributes to antiapoptotic signalling of melanocytes in dermal collagen.Cancer Res,2002,62(16):4820-4828.

［5］Keyes K,Cox K，Treadway P，et al．An in vitro tumor model：analysis of angiogenic factor expression after chemotherapy．Cancer Res，2002，62(19)：5597-5602．

［6］Yan X, Zhong W,Tang A ,et al.Multiplexed flow cytometric immunoassay for influenza virus detection and differentiation1.Anal Chem,2005,77(23):7673.

［7］Biagini RE,Schlottmann SA,Sammons DL,et al.Method for simultaneous measurement of antibodies to 23 pneumococcal capsular polysaccharides.Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(5):744.

［8］Wong SJ,Boyle RH,Demarest VL,et al.Immunoassay targeting nonstructural protein 5 to differentiate Weast Nile virus infection from dengue and St.Louis encephalitis virus infections and from flavivirus vaccination.J Clin Microbiol,2003,41(9):4217.

［9］Gorelik E,Landsittel DP,Marrangoni AM,et al.Multiplexed immunobead-based cytokine profiling for early detection of ovarian cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(4):981.

［10］Johannisson A,Jonasson R,Dernfalk J,et al.Simultaneous detection of porcine proinflammatory cytokines using multiplex flow cytometry by the xMAP technology.Cytometry A,2006,69(5):391.

［11］涂学亮，朱冲，王坤，等.多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统对前列腺癌的诊断价值.检验医学与临床,2008，5（14）：863.

［12］Derveaux S,Stubbe BG,Braeckmans K,et al.Synergism between particle-based multiplexing and microfluidics technologies may bring diagnostics closer to the patient.Anal Bioanal Chem,2008,391(7):2453.

【收稿日期】2011-06-28

（本文编辑：陈春梅）

推荐访问： 液相 芯片 前列腺癌

---