实时荧光PCR技术检测过敏原小麦的研究

材料与方法

１．１材料

实验于２００８年８月在辽宁出入境检验检疫局技术中心实验室进行。实验所用小麦、大麦、燕麦、荞麦、黑麦、白芝麻、糙米、绿豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰国香米、花豆、黑小豆、黄豆、豌豆、饭豆、黑大米、胡萝卜、大白菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米和小米这２６份样品由大连农业科学院、沈阳农业大学等多家单位提供，或购于大连家乐福超市。ＴａｑMａｎ ＧＥｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ酶预混液购于美国ＡＢＩ公司。用于ＤＮＡ提取的主要试剂ＣＴＡＢ缓冲液配制方法为５５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣＴＡＢ，１ ４００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，

２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，用１０％盐酸调ｐＨ值至８．０，１２１℃，高压灭菌２０ ｍｉｎ，备用。实验采用的仪器有ＡＢＩ ７３００实时荧光ＰＣＲ仪，核酸蛋白分析仪，台式高速冷冻离心机。

１．２方法

１．２．１基因组ＤＮＡ的抽提采用宝生物工程（大连）有限公司生产的ＤＮＡ提取试剂盒（货号：ＤＶ８１１Ａ）并按其操作说明进行抽提样品的ＤＮＡ。

１．２．２ＤＮＡ浓度和纯度的测定 取５ μＬ ＤＮＡ溶液加ｄｄＨ２Ｏ梯度稀释至１ ｍＬ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ ｎｍ和２８０ ｎｍ处的吸光值。ＤＮＡ的浓度按照公式Ｃ＝Ａ×Ｎ×５０÷１０００计算获得，式中Ｃ为ＤＮＡ浓度（μｇ／μＬ），Ａ为２６０ ｎｍ处的吸光值，Ｎ为核酸稀释倍数。ＯＤ２６０＝１．０表示双链ＤＮＡ浓度为５０ μｇ／ｍＬ。当ＯＤ２６０／ＯＤ２8０比值为１．７～１．９时，适宜于ＰＣＲ扩增。

１．２．３引物和探针设计 根据ＮＣＢＩ上已公布的小麦管家基因ＧＡＧ５６Ｄ和Ｗｘ０１２基因的核酸序列，在引物的设计上对小麦管家基因检测引物和探针的退火温度的一致性、ＧＣ含量的相似性等因素进行了充分的考虑，采用ＤＮＡＭＡＮ ８．０软件设计了小麦管家基因ＧＡＧ５６Ｄ和Ｗｘ０１２基因的引物和探针。检测ＧＡＧ５６Ｄ基因的引物和探针序列中正向引物为：５′－ＣＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＡ－３′；反向引物为：５′－ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＡＴ ＧＧＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＧＴ Ｔ－３′；探针为：５′－ＦＡＭ－ＴＴＣ ＣＣＧ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＣＧ Ｃ－Ｅｃｌｉｐｓｅ－３′。检测Ｗｘ０１２基因的引物和探针序列中正向引物为：５′－ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＧＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＴＧ Ｔ－３′；反向引物为：５′－ＧＧＴ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＧＡ ＡＡ－３′；探针为：５′－ＦＡＭ－ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＧＡ ＡＡＴ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣ－Ｅｃｌｉｐｓｅ－３′。

１．２．４实时ＰＣＲ反应体系和反应程序 实时ＰＣＲ反应体系为：１０×ＰＣＲ buffer（含Ｍｇ２＋）５ μＬ、正反向引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ、探针（１０ μｍｏｌ／Ｌ）１ μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）２ μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ、模板ＤＮＡ（０．１～２．０ μｇ／μＬ）２ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ补足至２５ μＬ。实时ＰＣＲ反应程序为：９５℃、１０ ｍｉｎ，１个循环；９５℃、１５ ｓ，６０℃、１ ｍｉｎ，４０个循环，在每次循环的退火时收集荧光。检测结束后，根据扩增曲线和Ｃｔ值判定结果。

１．２．５结果判断同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ｃｔ值≤３５，则判断样品中检出过敏原小麦成分。若检测样品荧光增幅曲线的Ｃｔ值为３５～４０，则应重新进行实时荧光ＰＣＲ反应。再次扩增后的结果Ｃｔ值仍为３５～４０，可判断样品中检出过敏原小麦成分，否则可判断样品中未检出过敏原小麦成分。

１．２．６特异性实验选取与样品同科同属的物种，用于待测样品的特异性实验。

１．２．７灵敏度实验将小麦样品研磨粉碎处理后，按照不同的重量比分别添加到不含小麦过敏原基因的植物为原料的米粉基质中，制备成２０．０、１０．０、 ５．０、２．０、１．０、０．５、０．２、０．１、０．０ ｍｇ／ｋｇ共９个梯度含量的添加样品。应用本方法分别进行检测，以确定本方法的检测灵敏度。

２结果与分析

２．１特异性分析结果

采用小麦管家基因ＧＡＧ５６Ｄ和Ｗｘ０１２基因引物和探针进行检测，２６种样品经ＴａｑMａｎ 探针实时ＰＣＲ扩增，只有小麦产生荧光信号，其余样品均未产生荧光信号（图１）。可见，本研究所采用的小麦管家基因ＧＡＧ５６Ｄ和Ｗｘ０１２基因检测引物和探针具有很好的特异性。

２．２灵敏度实验结果

检测结果表明（图２），含量分别为２０．０、１０．０、５．０、２．０、１．０ ｍｇ／ｋｇ的小麦过敏原添加样品均能很好地检出荧光信号，而低于０．５ ｍｇ／ｋｇ含量的添加样品则检测不出荧光信号。表明该方法对小麦过敏原基因的检测灵敏度较高，可达到１．０ ｍｇ／ｋｇ。

２．３实际应用检测

运用本方法共检测了２８０份实际样品。其中检测小麦原料样品７３份，阳性符合率为１００％。检测小麦加工制品９５份，阳性符合率也为１００％。检测婴儿食品和小食品１１２份，其中检出含有小麦过敏原基因的样品为２１份，其余９１份样品未检出小麦过敏原基因，这些结果与食品标签的标识相符合。由大量的实际应用结果可见，应用本方法检测小麦过敏原基因成分，具有较好的应用效果。

３讨论

目前针对食品过敏原的检测方法，主要有体内检测的皮肤实验和双盲安慰剂对照激发实验、体外检测的血清ＩｇＥ实验和组胺释放实验，ＰＣＲ检测以及实时荧光ＰＣＲ检测方法等［４］。传统的体内检测实验直接检测是否存在过敏蛋白质，由于过敏蛋白质通常痕量存在而被食品基质掩盖，造成实验结果假阴性。ＤＮＡ比蛋白质更耐受热处理和压力作用，尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体。ＰＣＲ方法中，在热变性条件下目标ＤＮＡ可以有效提取而不像蛋白质提取时受食物基质的影响较大；它的另一个优点是它的稳定性，它不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响。

实时荧光ＰＣＲ技术与常规ＰＣＲ相比，它具有特异准确、可有效解决ＰＣＲ污染问题、自动化程度高等特点。可以通过在ＰＣＲ扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个ＰＣＲ进程。因此可以通过实时荧光ＰＣＲ方法更快更准确地检测出食品过敏原成分基因，从而判断食品中是否存在过敏原［５］。

本研究采用实时荧光ＰＣＲ技术，建立了食品中过敏原小麦成分快速检测方法，方法的灵敏度高，检测低限可达到１．０ ｍｇ／ｋｇ；方法特异性强，与对照组２５种样品无交叉反应。在实际应用检测中，共检测２８０份样品，阳性符合率为１００％，具有较好的应用效果。该方法操作步骤简单，检测时限短，结果判断准确，适用于小麦过敏原的快速诊断和大量样品的检测。

参考文献：

［１］ 黄峙，郭宝江． 食品过敏原检测与评价技术研究进展［Ｊ］． 食品科学，２００３，２４（８）：２４０－２４４．

［２］ 毛炜翔，高金燕，陈红兵．小麦过敏研究进展［Ｊ］．食品科学，２００７， ２８（８）：８７－９０．

［３］ ＨＥＩＤ Ｃ Ａ，ＳＲＥＶＲＮＳ Ｊ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，６（１０）：９８６－９９４．

［４］ 顾可飞，李春红． 食物过敏原及检测技术的研究进展［Ｊ］． 食品科技，２００６，３１（８）：４２－４４．

［５］ ＨＩＲＤ Ｈ，ＬＬＯＹＤ Ｊ，ＧＯＯＤＩＥＲ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，２１７（３）：２６５－２６８．

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