彗星试验检测哺乳动物细胞DNA损伤样品制备方法

摘要：彗星试验（comet assay）是近年来逐步发展起来的1种检测单细胞水平DNA损伤的新技术，该技术已被广泛应用于遗传毒理学、，辐射生物学、环境生态学等领域。在碱性SCGE基础上，对哺乳动物细胞SCGE检测样品制备的方法进行了改进与优化，使改进后的方法更加快速简便、易于推广。

关键词：彗星实验（单细胞凝胶电泳）；DNA损伤；HepG2细胞；电泳图像质量

中图分类号： Q291；X503.22文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0041-02

收稿日期：2013-10-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31100379）；江苏省高校自然科学基金（编号：11KJB610001）；中国博士后科学基金（编号：20100470062）；江苏省博士后基金（编号：1001024C）。

作者简介：王楠（1984—），男，山西大同人，硕士，从事环境毒理学研究。E-mail：nan.wuhan.2006@163.com

通信作者：杜道林，博士，教授，从事生态学研究。E-mail：ddl@ujs.edu.cn。DNA存储着生物体赖以生存繁衍的遗传信息，细胞DNA损伤是细胞生物学领域的研究热点之一。当细胞受到损伤时，其DNA双链会发生断裂，断裂过程中会发生特异性级联生化反应，依赖Ca2+、Mg2+的核酸内切酶被激活，优先作用于连接DNA的核小体间区域，将DNA链切割成180～200 bp或其倍数的片段，在彗星电泳中发生断裂的DNA迁移速度与迁移距离均数倍于正常细胞的核DNA，呈现脱离细胞核的“彗星”状，据此可将DNA受损细胞与正常细胞区分开[1]。彗星试验（comet assay）也被称作单细胞凝胶电泳（SCGE），是1种在单细胞水平上检测真核细胞DNA损伤的方法。通过测定细胞电泳时彗星出现率、彗尾DNA含量百分比、彗尾长度等指标，即可对细胞药物引起细胞DNA损伤进行全面评价[2]。1993年，Olive等首次将彗星试验应用于细胞凋亡检测[3]。真核细胞的DNA分子量较大，DNA呈负超螺旋结构附着在核基质中，采用琼脂糖凝胶将细胞包埋在细胞裂解液下，细胞膜、核膜等被破坏，细胞内的RNA、蛋白质等其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，核DNA仍然保持缠绕状，附着在剩余的核骨架上，并留在原位。在强碱（pH值为13）电泳液中电泳时，若细胞未受到损伤，核DNA分子量大且未发生断裂，仍停留在核基质中，经荧光染料染色后，核在原位形成1个明亮的头部，无拖尾现象；若细胞受损，会出现DNA单链或双链断裂，强碱环境下DNA解旋为单链，DNA断裂片段进入凝胶中，在电场力作用下，断裂的DNA片段因携带负电荷脱离核DNA向阳极移动，DNA碎片形成彗星状尾部，即可形成彗星图像。彗星电泳检测技术具有所需样品量少、适用于任何真核细胞、灵敏度高、细胞不需处于有丝分裂期、无需放射性标记等优点，已被广泛应用于真核细胞DNA损伤及修复、药物筛选、肿瘤发病机制与治疗等研究。目前，用于彗星电泳检测分析的样品制备过程主要包括样品凝胶制备、细胞裂解、解旋与电泳、中和洗涤、荧光染色、采用彗星凝胶电泳摄像系统拍摄荧光照片等步骤。通常，荧光染色步骤中所使用的荧光染料为溴化乙锭（ethidium bromide，EB），EB是1种强诱变剂，容易挥发，对操作人员的健康造成威胁。使用后的染色玻片直接扔进垃圾箱可能会对周围环境造成潜在危害。此外，目前用于彗星电泳分析所制备的凝胶玻片通常要铺3层凝胶，且在后续裂解、电泳及漂洗过程中，凝胶极易脱离载玻片，造成制胶失败，影响彗星电泳技术的推广与应用。咪唑类离子液体因具有不挥发、不易燃、导电性强、性质稳定、对许多无机盐及有机物有良好的溶解性等物化性质，使得其在化学合成、催化、电化学、分析化学等领域得到了广泛应用[4]。然而，研究表明，咪唑类离子液体不仅对细菌及真菌的生长具有很强的抑制作用，对人类上皮细胞也具有较强的细胞毒性，且细胞毒性随着离子液体烷基侧链长度的增加而增加[5-8]。本研究采用基于人肝脏肿瘤细胞系HepG2的彗星试验检测了离子液体1-丁基-3-甲基溴代盐（[C8mim]Br）的DNA损伤作用，旨在为评价咪唑类离子液体的遗传毒性提供依据。

1材料与方法

1.1材料

[C8mim]Br（上海成捷化学有限公司），纯度>99%，[C8mim]Br用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）溶解，贮存液浓度为10 mol/L，4 ℃保存，临用时用10%胎牛血清培养液稀释至所需浓度；DMEM培养基、正常熔点琼脂糖（NMA）、低熔点琼脂糖（LMA）、Gel Red核酸凝胶染料均为美国Gibco公司产品；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），-20 ℃ 保存，临用时经56 ℃水浴灭活 30 min；胰蛋白酶（美国Amresco公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

CO2培养箱（美国Heal Force公司）、TE601-L电子天平、BS124S分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、JM250水平电泳仪（大连捷迈科技发展有限公司）、Ti-E2000型倒置荧光显微镜（Nikon公司）、超净工作台（苏州市新区枫桥净化设备厂）。

1.3方法

1.3.1细胞培养HepG2细胞来源于American Type Culture Collection（ATCC HB-8065），购自江苏大学药学院。细胞贴壁生长于DMEM培养液中，培养液中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，每天换液，每隔2～3 d传代。

1.3.2细胞处理取处于对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液收获，调节细胞浓度为1×106个/mL，接种于6孔板中，培养24 h至80%融合度，分别加入[C8mim]Br至终浓度为1、2 mmol/L，37 ℃下作用24 h，以0.1 mmol/L H2O2作为阳性对照，作用1 h。以PBS为阴性对照。细胞染毒后，用PBS洗涤2次，800 r/min离心5 min收集细胞，将细胞重悬于1 mL预冷PBS中，用台盼蓝法测定细胞存活率>95%，调整细胞浓度为1×105～5×105个/mL备用。

1.3.3凝胶制备第1层胶制备：将100 μL 1%正常熔点的琼脂糖滴至磨砂边载玻片上，用另一块玻片均匀推开，盖上盖玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2层胶制备：将 60 μL 待测细胞悬液与0.78%低熔点琼脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（体积比）混合，滴80 μL上述混合液至第1层胶上，盖上盖玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到铺有2层凝胶的玻片。

1.3.4细胞裂解用弯头镊子小心平移走盖玻片，将铺有2层凝胶的玻片浸入装有预冷细胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值為10的Tris缓冲液、1%肌氨酸钠、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出载玻片，用蒸馏水轻轻漂洗2次。

1.3.5DNA解链与电泳将上述细胞裂解后的玻片置于水平电泳槽正极端，缓缓倒入新配制的电泳缓冲液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值为13），约覆盖过玻片胶面0.3 cm左右，避光静置30 min，电泳电压为25 V，电流 300 mA 电泳20 min。

1.3.6中和脱水将电泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值为7.5 的Tris-HCl中和缓冲液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗净，玻片依次经体积分数为50%、75%、100%的乙醇梯度脱水，每次2 min，室温下晾干。

1.3.7荧光染色在脱水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝胶染料，用盖玻片轻轻推开Gel Red染料，使Gel Red在琼脂糖表面均匀铺开，盖上盖玻片，避光染色10 min。

1.3.8 镜检拍照将制得的样品玻片与空白对照玻片置于倒置荧光显微镜下，激发波长为515～560 nm，用100倍物镜观察，每个样本随机选择10～20个细胞拍照摄取图像。每个样品玻片随机选取10个拖尾细胞，采用CASP彗星分析软件测量彗星尾长（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9数据分析采用Origin7.5软件分析数据。

2结果与分析

，[C8mim]Br与HepG2细胞接触24 h，在荧光显微镜下，经Gel Red 染色的细胞DNA呈橘红色，未发生断裂的DNA只有1个完整的头部，断裂的DNA形成拖尾，HepG2细胞呈现“彗星”样细胞，，随着[C8mim]Br剂量的增加，拖尾现象更加明显，表明细胞DNA损伤程度加重。由表1可知，咪唑类离子液体[C8mim]Br可诱发HepG2细胞DNA原始损伤。

表1不同浓度[C8mim]Br 下HepG2细胞DNA损伤程度

受试物浓度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾长（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列数据后“**”表示差异极显著。

3结论与讨论

彗星试验是一种灵敏、可靠的检测细胞核DNA损伤的技术，可以检测DNA双链断裂、单链断裂、碱基不稳定位点等多种类型损伤，是评价外来化合物遗传毒性的有效手段。近年来，研究人员采用HepG2细胞彗星试验对消毒剂处理饮用水的有机提取物以及农药等的遗传毒性进行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝胶制片步骤只要铺2层胶，与传统的彗星试验样品玻片要铺3层胶的“三明治”铺胶工艺相比，具有可操作性强、不易脱胶、易于推广等优点。同时，采用梯度乙醇对样本进行脱水，可使样本脱水更加彻底，分析彗星电泳图像时，可减弱荧光衰减程度，提高图像质量。此外，与传统荧光染料相比，Gel Red核酸凝胶染料低毒、稳定，对哺乳动物细胞毒性小，且废弃物不会造成环境污染。

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