抗苄嘧磺隆雨久花乙酰乳酸合成酶突变的研究

摘要

本研究采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）结合RTPCR方法克隆抗苄嘧磺隆雨久花生物型和敏感性雨久花生物型乙酰乳酸合成酶（ALS）基因cDNA序列，并对测序结果进行比对分析。结果表明：与敏感性的雨久花ALS相比，公主岭（GZL）抗性生物型中第197位脯氨酸突变为组氨酸，第556位亮氨酸突变为苯丙氨酸；柳河（LH）抗性生物型中第358位天冬酰胺突变为天冬氨酸；磐石市（PS）抗性生物型中第525位缬氨酸突变为异亮氨酸。分析表明，高度保守区Domain A的第197位氨基酸残基的突变可能是导致公主岭稻区雨久花产生抗药性的主要原因之一，而其他抗性生物型抗性产生的原因有待进一步研究。

关键词

苄嘧磺隆；乙酰乳酸合成酶；抗药性；雨久花

中图分类号：

S 451.121

文献标识码：A

DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.015

Abstract

Acetolactate synthetase（ALS）gene sequences were cloned from Monochoria korsakowii resistant （R） and susceptible （S） biotypes against bensulfuronmethyl using the rapid amplification of cDNA ends （RACE）and RTPCR. Sequencing data revealed that Pro197His mutation and Leu556Phe mutation occurred in population GZL， while Asn358Asp mutation occurred in population LH， and Val525Ile mutation in population PS. The Pro197His mutation may be responsible for the resistance to bensulfuronmethyl in population GZL of M.korsakowii. The functions of the other three mutations in the R biotype need to be further investigated.

Key words

bensulfuronmethyl； acetolactate synthetase；herbicide resistance； Monochoria korsakowii

雨久花（Monochoria korsakowii）属于雨久花科（Pontederiaceae）雨久花属（Monochoria）多年生草本植物，在我国北方地区是主要的稻田恶性杂草之一。该杂草能在较短时间内对水稻造成郁蔽、遮光，导致稻田水温降低，水稻严重减产[12]。

磺酰脲类除草剂（SU）是水稻田防除雨久花的主要药剂之一，属于乙酰乳酸合成酶（ALS） 抑制剂类除草剂，该类除草剂因具有生物活性高、使用量低、杀草谱广、选择性强、对哺乳动物毒性低等优点被人们广泛使用[3]。但是由于该类药剂作用位点单一，杂草极易对其产生抗性，截至目前已有145 种杂草生物型对一种或多种ALS抑制剂类除草剂存在抗药性[4]。多数杂草对ALS抑制剂产生抗药性的主要原因是由于ALS基因发生突变进而导致ALS酶对抑制剂的敏感性降低。 目前，已报道的可导致杂草抗药性产生的ALS基因突变位点共8个：122 位丙氨酸（Ala122）被酪氨酸、缬氨酸或苏氨酸所取代[56]；197位脯氨酸（Pro197）被组氨酸、苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺所取代[79]；205位丙氨酸（Ala205）被缬氨酸所取代[10]； 376 位天冬氨酸（Asp376）被谷氨酸所取代[11]；377位精氨酸（Arg377）被组氨酸取代[9]；574位色氨酸（Trp574）被亮氨酸所取代[12]；653位的丝氨酸（Ser653）被苏氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸所取代[13]；654位甘氨酸（Gly654）被天冬氨酸取代[13]。有关雨久花抗药性的报道最早见于日本和韩国[1415]，研究只报道了抗药性雨久花对各种SU类除草剂的抗性水平，并未对其抗性机理进行深入研究。2009年卢宗志等[16]对雨久花抗药性生物型进行研究，获得了雨久花ALS片段，明确了Pro197的突变是导致柳河生物型产生抗药性的原因，但是并未克隆出雨久花ALS的全部保守区域。本研究利用RACE技术克隆雨久花抗药性与敏感性生物型ALS基因，从分子水平上揭示雨久花抗药性产生的根本原因，为延长除草剂的使用寿命、防止或延缓抗药性杂草的形成提供理论依据，同时也为培育除草剂抗性作物提供具有潜在应用价值的基因资源。

1材料与方法

1.1材料

抗药性雨久花种子于2011年分别采自吉林省的公主岭市（GZL）、柳河县（LH）和磐石市（PS）的水稻种植区。这些稻区多年来连续使用磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆和吡嘧磺隆。敏感性雨久花种子于2011年采自吉林省长春市净月潭附近水泡，该地区从未施用过任何除草剂。种子采回后经室内盆栽，待长至2～3叶期，用苄嘧磺隆分别进行抗性水平测定，表明公主岭市、柳河县和磐石市抗药性雨久花的抗性系数分别为6.3、13.7、9.0。收集抗药性生物型存活下来的种子备用。

将抗药性生物型和敏感性生物型的种子分别播种于直径20 cm，装有稻田土的塑料花盆内，置于温室中，培养条件为白天（26±5）℃，夜间（16±5）℃，光照强度18 000～25 000 lx，空气相对湿度（70±5）%。待长至3～5叶期时，每个样本采集0.1 g幼嫩叶片存放于-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成

根据卢宗志等[16]扩增获得的雨久花ALS基因片段序列，分别设计3′RACE 和5′RACE的基因特异性引物，并根据RACE PCR的测序结果设计扩增全长cDNA的引物（表1）。

1.2.2总RNA 的提取与第一链cDNA 的合成

叶片总RNA采用全式金公司的TransZol Up试剂盒提取，然后采用常规琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行检测。

第一链cDNA的合成、3′RACE cDNA 的合成、5′RACE cDNA 的合成分别采用Fermentas的ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kid、TaKaRa的3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase、Invitrogen的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends完成。

1.2.3ALS全长cDNA的克隆

利用RACE PCR技术扩增雨久花ALS的全长cDNA。3′RACE扩增，反应体系为50 μL：cDNA 1 μL，1×cDNA dilution buffer 8 μL，3′GSP1（10 μmol/L）2 μL，3′RACE outer primer（10 μmol/L）2 μL，10×LA PCR buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，LA Taq（5 U/μL）0.3 μL，补充无菌ddH2O至50 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。5′RACE第一轮扩增，反应体系50 μL：cDNA 5 μL，10×LA PCR buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）4 μL，5′GSP2（10 μmol/L）2 μL，AAP（10 μmol/L） 2 μL，LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，补充无菌ddH2O至50 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。以第一轮扩增的PCR产物100倍稀释液为模板进行巢式PCR扩增，用5′GSP3和AUAP为引物，除退火温度为56 ℃外，反应体系和反应程序均同第一轮扩增。将得到的产物克隆到pMD18T 载体上，挑选阳性克隆送至上海生工测序，随后进行拼接和分析。

根据拼接分析获得的序列设计引物F1和R1，扩增雨久花抗药性生物型和敏感性生物型ALS的cDNA全长，反应体系50 μL：cDNA 2 μL，10×LA PCR buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）4 μL，F1（10 μmol/L）、R1（10 μmol/L）各1 μL， LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，补充无菌ddH2O至50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，54.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，32个循环；72 ℃延伸8 min。回收PCR扩增产物，并连接到pMD18T 载体上，转化大肠杆菌，进行菌落PCR鉴定，将鉴定得到的阳性克隆送至上海生工进行测序。

1.2.4生物信息学分析

将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，然后利用DNAMAN软件对扩增出来的抗药型和敏感型雨久花ALS 基因进行拼接、比对分析。

2结果与分析

2.1雨久花总RNA检测结果

利用常规的琼脂糖凝胶电泳检测，质量好的RNA产物可以看到2条明显的rRNA条带，即28S rRNA和18S rRNA，其亮度比值约为2∶1，还可以看到5S rRNA。图1为雨久花总RNA的常规琼脂糖凝胶电泳检测结果，发现RNA略有降解，18S rRNA 的亮度等于28S rRNA，但不影响下一步试验。

2.2ALS基因的克隆

利用RACE PCR技术扩增目的条带。其中3′RACE扩增出3条特异性条带，只有1 000 bp的条带符合预期大小，5′RACE 扩增出约1 000 bp大小的特异性条带，符合预期大小（图2）。回收两条目的条带，连接、转化。挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定，结果扩增出与预期大小相符的特异性条带（图3）。

2.3雨久花ALS基因的生物信息学分析

将测序结果在NCBI上进行比对，发现利用3′RACE扩增出了ALS的3′末端编码区以及非编码区，但用5′RACE并未扩增出ALS的5′末端完整的编码区以及非编码区，仅扩增出了5′端的部分编码区。扩增得到的1 905 bp的片段在NCBI上比对，与已知雨久花ALS部分cDNA序列的同源性为99%，包含目前已报道的全部5个保守区域。

用DNAMAN软件对扩增出的抗药性和敏感性生物型雨久花ALS基因片段进行比对，发现与敏感性生物型相比，抗药性雨久花ALS编码区共有4个氨基酸残基发生突变（表2），在公主岭抗性生物型中Pro197突变为His197，Leu556突变为Phe556；在柳河抗性生物型中Asn358突变为Asp358，在磐石市抗性生物型中Val525突变为Ile525。其中只有第197位氨基酸残基的突变而导致抗性的产生被许多相关文献报道过，而另外3个氨基酸残基的突变目前未见报道。

3讨论

ALS基因的一个或者几个碱基发生突变可使其编码的ALS酶中相应的氨基酸被替换，进而可能会导致杂草对ALS抑制剂产生抗药性。ALS基因的过量表达也是杂草对ALS抑制剂产生抗药性的原因之一[17]。Boutsalis 等认为东方大蒜芥（Sisymbrium orientale L.）NS01种群产生抗药性不仅仅是因为ALS基因中Trp574被Leu574替换所致，ALS酶的过量表达也可能引起该种群对ALS抑制剂产生抗性[18]。以上均是由于ALS酶的改变而引起抗性的靶标机制。非靶标机制则是由于解毒代谢功能的增强而致使杂草逐渐形成抗性群体。Devine 等认为除草剂代谢涉及的主要代谢解毒酶类如谷胱甘肽还原酶、过氧化物歧化酶、细胞色素P450单加氧酶等含量和活性的提高都会使除草剂代谢为无毒化合物的能力加强[19]。此类抗性多发生于禾本科杂草，如澳大利亚西部6个雀麦群落以及稻田稗草等[5，20]。

本研究扩增出了约1 900 bp的ALS片段，包含了3′末端非编码区域以及已报道的全部5个保守区域。与雨久花敏感性生物型相比，在公主岭抗药性生物型中发现两个氨基酸被取代，即Pro197被His197取代、Leu556被Phe556取代。但只有第197位氨基酸位于保守区中，而第556位则位于非保守区。Pro197是目前报道最多的突变位点，也是取代种类最多样的一个位点，共有至少11种取代的氨基酸，Pro被这11种氨基酸中的任何一种取代都会使杂草对磺酰脲类除草剂产生很高的抗药性[3，4，21]，所以公主岭雨久花抗性生物型Pro197突变成His197可能是导致其产生抗药性的原因之一，而第556位氨基酸的突变是否也是杂草形成抗性的原因还尚不明确。在柳河抗性生物型中位于非保守区的Asn358被Asp358取代，而第197位氨基酸并未改变，这与2009年卢宗志等[16]对抗药性生物型雨久花的研究得到的结果有所不同，该研究认为Pro197被His197取代是导致柳河生物型产生抗药性的原因。而磐石抗性生物型中Val525被Ile525替换同样是发生在非保守区域，由于未见这2个位点发生突变而导致杂草产生抗药性的相关报道，因此柳河和磐石地区抗药性雨久花的发生是否是因为氨基酸发生突变或者是ALS酶过量表达的靶标机制引起的，还是由于非靶标机制引起的还需要进一步研究。

本试验利用RACE技术扩增出了雨久花ALS基因的3′端片段，但没有扩增出完整的5′端片段，没有得到ALS的cDNA全长，因此有必要改进方法，得到全长ALS，进一步研究ALS的功能，从而完整的揭示雨久花抗ALS抑制剂类除草剂的分子机制。

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（责任编辑：杨明丽）

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