金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究进展

摘要：金黄色葡萄球菌是引起人类细菌性食物中毒及奶牛乳房炎的重要细菌之一，在自然界中广泛分布。本文将重点介绍金黄色葡萄球菌的几种快速检测方法。

关键词：金黄色葡萄球菌；快速检测Research Advance on Staphylococcus Aureus Rapid Detection Method Zhang Ying

（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center, Tianjin, 300402）Abstract:Saphylococcus aureus is one of the most important bacterium which can cause bacterial food-poisoning and cow mastitis, it widespreads in nature. A few methods for the rapid detection of staphylococcus aureus are finally introduced.

Keywords: Saphylococcus aureus；rapid detection葡萄球菌属革兰氏阳性球菌，广泛分布于空气、水、土壤、饲料中，也存在于人、动物的体表、鼻咽喉及肠道,属于人兽共患病原菌。其中，金黄色葡萄球菌致病力最强，除引起皮肤组织及器官化脓炎症外，所产生的毒素污染食物，导致食物中毒。近年来，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件颇多。据美国疾控中心报道，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒位居第2位，仅次于大肠杆菌，占整个细菌性食物中毒病例的33%，加拿大则高达45%。同时，金黄色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病因子之一，给养殖业造成巨大的经济损失。

目前，金黄色葡萄球菌的快速检测方法大致可分为3种：一是快速检测培养基法；二是免疫学方法；三是以核酸为基础的分子生物学方法等[1]。

1快速检测培养基法

1.1显色培养基检测

显色培养基（Chromogenic/Fluorogenic Culture Media）是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基，减少了对菌株进行纯培养和进一步生化鉴定的步骤[2]。

1974年Dr.Alain研制的CHROMagar Staph aureus（CSA）是以金黄色葡萄球菌的DNA酶和凝固酶为主要标志酶，以甲苯胺蓝、甲基绿、吖啶橙和5-溴-4-氯-3吲哚-胸苷-3磷酸等为显色底物来鉴定该菌的显色培养基。法国梅里埃公司研制的Baird Parker+Rabbit Plasma Fibrinogen(RPF)培养基，通过培养，生长出的灰色到黑色的且不透明的菌落即为金黄色葡萄球菌，因该培养基中含有兔血浆，所以无需作血浆凝固酶试验做进一步确认[3]。黄吉城等[4]人曾用该培养基和国标法相比较，总相符率达98%，且检测时间大大缩短。另外，我国青岛海博生物公司也研制出类似产品，现已被广泛使用。

1.2纸片法

利用金黄色葡萄球菌在培养过程中产生的热稳定核酸酶与显色剂反应形成粉红色环来检测该菌的存在。

美国3M公司生产的PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片，该测试片有两部分组成，一部分是经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌有很强的选择性，另一部分是含有显色剂和脱氧核糖核酸（DNA）的反应片。Schoeller[5]曾对食品中金黄色葡萄球菌进行传统方法和3M纸片法的比较，试验证明3M纸片的特异性强，检测时间短。吴仲梁等[6]人曾用该测试片进行食品检样，结果显示，PetrifilmTM检出率达93.3%。

2 免疫学检测方法

利用抗原与相应抗体特异性结合为理论基础进行金黄色葡萄球菌的检测，操作简单，特异性强，灵敏度高，适用于大批量样品的检测。

2.1酶联免疫（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术

ELISA法是免疫诊断中最常用的方法，在进行金黄色葡萄球菌的检测中常采用“夹心法”。 Schotte[7]曾报道一种改良的ELISA方法——快速免疫色析手工操作法，能够在15 min之内检测500 pg/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素。但是ELISA法也存在一些缺陷，试验中所用到的试剂选择性高，价格昂贵，易受环境、温度、时间等条件的影响。

2.2免疫荧光（Immunofluorescence Assay,IFA）技术

根据抗原抗体特异性结合的反应特点，将已知抗体与荧光色素以化学方法结合制成荧光标记物，在特定条件下，使样品与其发生结合反应，之后在荧光显微镜下观察是否有荧光标记的抗原抗体复合物存在，若存在则证明该样品含有金黄色葡萄球菌。1991年，Rowe等[8]用免疫荧光法分别达到了检测出混合样品中高分子量的金黄色葡萄球菌肠毒素和低分子量的金黄色葡萄球菌肠毒素的目的。2004年，Tim Alefantis[9]开发出一种基于免疫双抗体夹心荧光法的快速检测金葡菌肠毒素的方法，相比传统方法，检测时间大大缩短，全程需40～50 min。

2.3反向被动乳胶凝集试验（Reverse Passive Latex Agglutination,RPLA）

RPLA法是采用间接凝集反应的原理，将特异性抗体吸附于乳胶颗粒上，当抗原抗体发生特异性结合时，乳胶发生凝集反应，其凝集程度与待测样品中细菌含量成正比。法国梅里埃公司的Slidex Staph-kit 在检测样品时，20 s即可读出结果[10]。Trisum 公司的Aureus TsetTM则1 min内可观察结果[11]。RPLA虽简单易行，但是致敏的乳胶易发生自凝，从而影响反应的灵敏度，造成检测结果不准确，另外，该方法只能检测金黄色葡萄球菌的肠毒素。

3 分子生物学检测

3.1聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）

该方法克服了传统检测方法的不足，近年来发展比较迅速且被多种领域所应用。国外最早采用PCR方法从食品中检测金黄色葡萄球菌的报道是在1991年，WILSON等[12]采用该方法，8 h内即可检出人工污染的干燥脱脂奶中的金黄色葡萄球菌肠毒素B和C1，靶DNA检出限达到1 fg（<10个细胞），灵敏度非常高。该方法由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。李秀娟等[13]人曾利用PCR对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）保守区域进行扩增并进行特异性检测，结果显示用PCR法检出的阳性率为37.5%，而传统细菌分离培养法检出的阳性率为31.3%。但是，PCR技术也有一些弊病，如试验费用高，试验技术要求较高，不适合向基层推广。

3.2核酸探针技术

该技术具有快速、灵敏、特异性强等优点。Noterman等人最早应用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法。其原理是利用了核苷酸碱基序列互补的原则，用特异的DNA探针通过核酸分子杂交来检测未知样品的抗原。近年来，Gene Tark推出检测金黄色葡萄球菌的探针，采用浸染棒比色法，敏感性达100%，假阳性率为9.3%，人工感染样品中没有假阳性结果发生[14]。但是该技术操作也较繁琐、费时。

3.3基因芯片技术

基因芯片技术是近年来才迅速发展起来的一种反向固相杂交的高新技术，具有高通量、快速、灵敏的特点，其原理是设计一种检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸探针，以一定方式固定在硝酸膜上，制成基因芯片，利用引物对靶基因进行扩增和标记，并与基因芯片在适当条件下杂交，根据杂交结果鉴定金黄色葡萄球菌是否存在。李秀萍等[15]人曾利用该技术对奶牛乳房炎主要致病菌进行检测，特异性较好，准确率高，可操作性强，为临床治疗提供有力的依据。

3.4 环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)

该技术通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件下进行反应，1 h内可完成核酸扩增反应，呈现出LAMP特征性梯状条带，扩增结果可通过肉眼观察判定结果。不需要模板的热变性、长时间的温度循环以及繁琐的电泳等过程，同时也不需要昂贵的仪器设备，快速灵敏，特异性强，成本低，尤其适合大量、即时、现场的病原微生物的检测，是真正的普及型的核酸检测方法，易于在基层推广。2003年开始逐步被用于医学的临床检测，2005年在动物疫病检测方面有所应用，吴绍强等[16]建立亚洲I型口蹄疫病毒的RT-LAMP检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成沉淀等现象判定结果，为口蹄疫的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法，满足现场检疫的需要。杨秋林等[17]应用LAMP技术检测弓形虫，显示出较好的特异性和敏感性。江彦增等[18]利用LAMP方法检测非洲猪瘟病毒，其灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍，并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。随着人们对该技术的不断改良，相信LAMP技术会在各领域充分发挥其作用。■（编辑：狄慧）

参考文献：

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[2]张淑红，吴清平，张菊梅，等.显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用[J].微生物学通报，2006,33（6）：108-111.

[3]李毅.金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展[J].中国卫生检验杂志，2004,14（4）：392-395.

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[7]Schotte U,Langfeldt N,Peruski AH.Detection of staphylococcal enterotoxinB(SEB)by enay me linked immunosorbent assay and by a rapid hand held assay[J].Clin Lab,2002,48(7-8):395-400.

[8]Rowe C A,Scruggs S B,Feldstein M J.An array immunosensor for simultaneous detection of clinical analyte[J].Anal Chen,1999,71:433-439.

[9]Tim Alefantis,Paul Grewal,John Asldon,et al.A rapid and sensitive magnetic bead-based immunoassay for the detection of staphylococcal enteroto xin B for high-through put screening[J].Mol Cell Probes,2004,18,6:376-382.

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[15]李秀萍，尹逊河，吴时友，等.基因芯片检测奶牛乳房炎主要致病菌的方法研究[C].牛羊传染病第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会，2005,998-1001.

[16]吴绍强，孙晓智，林祥海，等.亚洲I型口蹄疫病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立[J].检验检疫科学，2008,18（1）：9-12.

[17]杨秋林，张如胜，伍和平，等.应用环介导等温扩增技术检测弓形虫[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008,26（4）：304-306.

[18]江彦增，朱鸿飞.非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立[J].中国畜牧兽医，2009，36（2）：72-74.

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