一株产油酵母菌的紫外诱变选育

摘要：以产油酵母菌Y1为试验菌株，通过确定出发菌株Y1的最佳紫外诱变时间，诱变后菌株的初筛和复筛，得到了一株突变菌株Y9。测得Y9的油脂产量为5.25 g/L，油脂含量为23.85%。与菌株Y1油脂产量2.11 g/L、含油量9.6%相比，Y9的产油量有明显提高，因此拟选取油脂产量较高的Y9作为后续摇瓶发酵产脂研究的实验菌株。

关键词：产油酵母；紫外诱变；诱变选育；油脂产量

中图分类号：Q93-331 文献标志码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5463-03

我国人均石化资源贮量十分有限，而能源需求量却与日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潜在油源[1]。由微生物生产富含多种生理功能的不饱和脂肪酸油脂已引起国内外的广泛重视，因此微生物油脂的研究将成为21世纪油脂工业的一个重要方向[2]。微生物油脂，又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌和细菌等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的油脂[3]。自然界中一些产油微生物在碳源充足而其他营养成分（通常为氮源）缺乏情况下，可以在胞内大量积累油脂，甚至达到自身干重60%以上[4]。产油酵母产脂发酵生产通常以单糖作为碳源，许多廉价原料如油料作物秸秆、炼油饼渣、废糖液等通过化学或生物水解方式降解成单糖后可用于产油酵母产脂发酵[5，6]。

本研究以产油酵母菌Y1为实验菌株，对不同紫外诱变时间进行研究，确定Y1的最佳紫外诱变时间，对诱变后菌株进行初筛和复筛后获得油脂产量较高的突变菌株，以期为大规模发酵生产微生物油脂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 产油酵母菌Y1，包头师范学院生物科学与技术学院实验中心保藏。

1.1.2 培养基和试剂 苏丹黑B染色液，苏丹黑B 0.5 g，加入75%乙醇100 mL，水浴加热使其充分溶解，待其冷却后过滤，得出的滤液即为苏丹黑B染色液。液体种子培养基：葡萄糖 20 g/L，（NH4）2SO4 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，酵母粉0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。基础发酵产脂培养基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨1.5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 初始菌株含油量测定

1）酵母菌Y1种子液的培养。取活化后斜面酵母菌Y1一环，接种于500 mL液体种子培养基中，28 ℃、180 r/min培养14 h，备用。

2）产脂发酵。以10%接种量接入液体种子，100 mL摇瓶装液量25 mL，160 r/min、28 ℃恒温振荡培养48 h。

3）苏丹黑B染色镜检。从培养平板挑取菌体涂片固定，用苏丹黑B染色15 min，二甲苯冲洗，洗脱无色后再用番红复染，水洗，吸干后显微镜观察，菌体内脂肪颗粒呈蓝黑色。

4）油脂提取。每克干菌体加入4 mol/L HCl 6 mL，振荡混匀，室温下放置30 min后，沸水浴3 min，-20℃速冷，加入10 mL氯仿∶甲醇（1∶1），充分振荡后，4 500 r/min离心15 min，取氯仿层，加入等体积0.1%氯化钠溶液，混匀，4 500 r/min离心15 min，用已知质量的蒸馏瓶收集氯仿层，用旋转蒸发器挥发除去氯仿层，称重，计算油脂产量（g/L）和菌体含油量（油脂得率），计算公式如下：

油脂产量=油脂质量/所用发酵液体积

油脂得率=油脂质量/干菌体质量×100%

1.2.2 紫外诱变处理菌悬液的制备 挑取已活化的斜面菌种1环接种到种子培养基中，28 ℃、180 r/min摇床培养48 h。吸取培养液于无菌离心管中，5 000 r/min离心5 min收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，并稀释为细胞浓度106个/mL，得菌悬液备用。

1.2.3 出发菌株最佳诱变时间的确定 取1 mL菌悬液于直径60 cm培养皿中，开启紫外灯（25 W），照射距离36 cm，开盖进行紫外线照射，分别照射10、30、50、70、90 s后加盖，无菌条件下取0.1 mL照射后菌悬液在固体培养基中涂平板，用黑布包裹培养皿后，在28 ℃培养箱培养2 d。紫外辐照处理后，选择酵母菌致死率为75%～80%时的照射时间为最佳诱变时间[7]。

1.2.4 高产菌株的筛选 对目检出的各种形态的菌落进行初筛和复筛以选出高产菌株。

初筛：从平板上长出的菌落中，挑取出直径较大、光泽度好、颜色鲜红、质地黏稠的单菌落，移至斜面，保藏。苏丹黑染色后镜检出脂肪粒大且多的菌落，同时将该菌保存于斜面培养基。对培养皿和将要涂片的菌落进行一对一标号。

复筛：在初筛的基础上，将脂肪粒大的菌落的斜面以3环的接种量接入100 mL产脂培养基，于30 ℃的恒温摇床上培养4 d[8]，检测其生物量、油脂产量，筛选出生物量和油脂产量均较高的菌株。

1.2.5 菌体生物量的测定 取50 mL发酵培养液置于100 mL离心管内，4 500 r/min离心10 min，收集菌体并在65 ℃下干燥至衡重，准确称取干菌体质量，计算公式如下：

菌体生物量=干菌体质量/发酵液体积

1.2.6 菌体油脂的提取 每克干菌体加入4 mol/L HCl 6 mL，振荡混匀，室温下放置30 min后，沸水浴3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿∶甲醇（1∶1），充分振荡后，4 500 r/min离心15 min，取氯仿层，加入等体积0.1%氯化钠溶液混匀，4 500 r/min离心15 min，用已知质量的蒸馏瓶收集氯仿层，用旋转蒸发器挥发除去氯仿层，称重计算油脂产量和菌体含油量。

1.2.7 遗传稳定性实验 将复筛的菌株接种至斜面培养基，连续传代6次，摇瓶发酵后测其油脂产量，若油脂产量无显著变化，说明其遗传性状稳定。

2 结果与分析

2.1 初始菌株含油量

经苏丹黑B染色后，显微镜下可见初始菌株Y1菌体内含有一定数量的呈黑绿色脂肪颗粒，经测定此菌株含油量为9.6%，油脂产量为2.11 g/L，菌体油脂呈深绿色。有资料显示，含油量在20%左右的产油菌株即具有潜在的生产开发价值[1]，因此后续实验旨在提高该菌株的油脂产量和含油率，使其能够成为具有生产开发价值的产油菌株。

2.2 紫外诱变的最佳诱变时间

通过不同时间梯度的紫外诱变后，其菌体致死情况见表1，选择酵母菌致死率为75%～80%时的照射时间为最佳诱变时间[7]。由表1可知，该菌株的最佳紫外诱变时间为50 s。

2.3 紫外诱变初筛结果

苏丹黑染色后镜检出脂肪粒大且多的菌落，以染色程度的深浅作为初筛的指标进行筛选。由表2可知，经初筛后通过染色程度挑选出Y2、Y8、Y9、Y12、Y17菌株进行复筛。

2.4 紫外诱变复筛结果

将初筛得到的Y2、Y8、Y9、Y12、Y17菌株分别以3环的接种量接入100 mL产脂培养基，其复筛结果见表3。由表3可知，Y9的油脂产量最高，为5.25 g/L。

2.5 紫外诱变遗传稳定性试验结果

将复筛后的突变株Y9接种固体斜面连续传代6次，分别测其油脂产量，结果见表4。由表4可知，突变株油脂产量无显著变化，证明其遗传性状稳定。

3 结论

通过对出发菌株酵母菌Y1的紫外诱变获得一株突变菌株Y9，测得Y9的油脂产量为5.25 g/L，油脂含量为23.85%。与出发菌株Y1油脂产量2.11 g/L、含油量9.6%相比有较明显提高，因此选取油脂产量较高的Y9作为后续摇瓶发酵产脂研究的试验菌株。

参考文献：

[1] 薛飞燕，张 栩，谭天伟.微生物油脂的研究进展及展望[J].生物加工过程，2005，3（1）：23-27.

[2] 赵宗保，华艳艳，刘 波.中国如何突破生物柴油产业的原料瓶颈[J].中国生物工程杂志，2005，25（11）：1-6.

[3] 咸 漠，甄 明，康亦兼，等.深黄被孢霉生物转化十六醇合成油脂的研究[J].高等学校化学学报，2000，21（7）：1108-1109.

[4] 邢大辉，潘安龙，薛冬桦，等.深黄被孢霉利用不同碳源产油脂比较[J].生物工程学报，2010，26（2）：189-193.

[5] MENG X， YANG J M， XU X， et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms[J]. Renew Energ，2009，34（1）：1-5.

[6] KAMISAKA Y，NODA N，SAKAI T，et al. Lipid bodies and lipid body formation in an Mortierella ramanniana var. angulispora oleaginous fungus[J]. Biochim Biophys Acta， 1999（2）：185-198.

[7] MURPHY D J，VANCE J. Mechanisms of lipid body formation[J]. Trends Biochem Sci，1999，24（3）：109-115.

[8] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

（责任编辑 龚 艳）

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