寻常型白癜风患者外周血IL-17mRNA的检测及其临床意义

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[摘要]目的:探讨IL-17mRNA在寻常型白癜风患者外周血中的表达及其临床意义。方法:采用荧光实时定量RT-PCR方法对21例进展期白癜风患者、23例稳定期白癜风患者及30例健康对照外周血IL-17mRNA含量进行检测,并分析其表达水平与疾病病程与皮损面积的相关性。结果:进展期白癜风患者外周血IL-17mRNA的水平与健康对照组相比显著升高(P<0.05),稳定期白癜风患者IL-17mRNA的水平与健康对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。白癜风患者IL-17mRNA的含量与病程无相关性(r=0.15,P>0.05),与皮损面积呈正相关(r=0.54,P<0.05)。结论:IL-17在白癜风发病过程中可能发挥一定的作用。

[关键词]白癜风;IL-17;实时荧光定量PCR

[中图分类号]R758.4+1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)02-0225-04

Serum level of IL-17mRNA in patients with vitiligo and its clinical significance

WANG Luan,YANG Hui-lan,FAN Jian-yong

(Department of Dermatology,the General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,Guangdong,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the level of IL-17mRNA in peripheral blood of patients with vitiligo.Methods21 cases of advanced vitiligo patients,23 cases of stable vitiligo patients and 30 healthy controls were eolled in this study. The level of IL-17mRNAwas detectedby using real-time PCR andthe relevance with the course of disease andlesion area were conducted by correlation analysis using spss 13.0 software.ResultsThe level ofIL-17mRNA in the advanced vitiligowas significantly higher than those of healthy controls(P<0.05).There were no significantly difference between the stable vitiligo and health controls(P>0.05). The level of IL-17mRNAwas no correlation with the course of vitiligo(r=0.15,P>0.05),and positively correlated with area of skin lesions(r=0.54,P<0.05).ConclusionIL-17may play a role in the pathogenesis of vitiligo.

Key words: vitiligo; IL-17; real-time fluorescence quantitative reversetranscriptase-polymerase chain reaction

白癜风是一种以黑素细胞特异性脱失为特征的皮肤病,其病因和确切发病机制至今尚不完全清楚,自身免疫学说受到越来越多的关注。Th17细胞是一类不同于Th1和Th2的CD4+T细胞亚群,此类细胞以分泌IL-17为主而得名。最近的研究表明,Th17细胞和自身免疫的发生密切相关,而其与白癜风的发病是否相关,目前尚无报道。故我们通过荧光实时定量PCR法检测寻常型白癜风患者外周血IL-17mRNA含量,并分析其与病程和皮损面积的相关性来探讨Th17细胞与白癜风的关系。

1材料和方法

1.1 研究对象:选取广州军区广州总医院皮肤科门诊2008年10月～2009年6月就诊并确诊为白癜风的44例患者,其中男23例,女21例,平均(30.3±9.6)岁,病程(2个月～10年)。对患者按文献[1]进行分型、分期。其中进展期21例,稳定期23例。泛发性5例,散发性21例,局限性12例,肢端性6例。皮损面积在25%及以下的37例,25%到50%的5例,50%以上的2例。所有患者均排除严重心脑血管疾病、肝肾疾病、感染、肿瘤及其它自身免疫性疾病,检测前一个月未接受任何免疫治疗。对照组30例均为本院健康体检者,其中男17例,女13例,平均年龄(27.2±9.5)岁,与患者组在年龄和性别比较,差异无统计学意义。

1.2 主要仪器及试剂:淋巴细胞分离液:购自北京鼎国生物技术有限责任公司;RNA抽提试剂:Trizol,购自美国Invitrogen Life Technologies公司;定量检测试剂盒:SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit,购自日本TaKaRa公司;ABI 7900 HT PCR仪:购自美国应用生物系统公司。

1.3 引物合成及序列:IL-17及内参β-actin上下游引物委托TaKaRa生物公司设计合成。

IL-17上游引物:5"-CCACCTCACCTTGGAATCTC-3"

下游:5"-CAGGATCTATTGCTGGATGG-3" 产物长度:205bp

β-actin上游引物:5"-TGGCACCCAGCACAATGAA-3"

下游:5"-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3"产物长度:184bp

1.4 方法

1.4.1 RNA抽提及逆转录反应:采集患者及正常人外周静脉血5ml,EDTA抗凝。用淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞,然后Trizol抽提淋巴细胞总RNA,核酸测定仪测A260/A280,要求在1.8～2.0之间,同时1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。逆转录反应:每10μl逆转录体系中加入上述总RNA200ng作为模板进行反应,逆转录条件:37℃15min,85℃5s。

1.4.2 SYBR荧光实时定量PCR:参照说明书设定的PCR程序:95℃10s变性,然后95℃5s,60℃30s重复40个循环进行扩增;设定熔解程序:95℃ 1min,65℃15s,从65℃缓慢升温至95℃,每升高0.5℃检测一次荧光信号值。反应结束仪器自动生成循环阈值(cyclethreshold,Ct值)及熔解曲线图。每个样本均设3个复孔,取其平均值进行比较,用IL-17和内参基因β-actin Ct值的差值(ΔCt)表示IL-17mRNA的相对含量。

1.5 统计学分析:实验结果用SPSS 13.0软件处理,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用方差分析,相关性检验采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 实时荧光定量PCR体系的确定:由目的基因IL-17mRNA和内参基因β-actin的扩增曲线和熔解曲线(图1-4)可见,IL-17mRNA和β-actin的扩增效率恒定,且均已达到平台期,;相应的阈值循环数(Ct)稳定,重现性好;它们的熔解曲线均为单峰特异,引物的特异性好且无引物二聚体产生。故可以使用该体系对目的基因IL-17进行定量。

2.2 各组白癜风患者外周血IL-17mRNA表达量的比较:21例进展期白癜风、23例稳定期白癜风和30例健康对照的IL-17mRNA表达量分别为3.232±1.137、1.672±0.896和1.432±0.954。进展期白癜风患者与健康对照相比,IL-17mRNA的含量明显升高,差异有统计学意义(t=2.43,P<0.05);进展期白癜风患者与稳定期白癜风患者相比,IL-17mRNA的含量明显升高,差异有统计学意义(t=2.14,P<0.05);稳定期白癜风患者与健康对照相比,IL-17mRNA的含量升高,但差异无统计学意义(t=1.25,P>0.05)。

2.3 白癜风患者IL-17mRNA表达量与病程及皮损面积的相关性:采用Pearson相关分析发现,白癜风患者外周血中IL-17mRNA的含量与病程无相关性(r=0.15,P>0.05);白癜风患者外周血IL-17mRNA的含量与皮损面积呈正相关(r=0.54,P<0.05)。

3讨论

当CD4+T细胞接受抗原刺激后,不同的细胞因子诱导其向不同的亚群分化。例如,当局部抗原递呈细胞产生IL-12时,尤其在IFN-γ的共同作用下,CD4+T细胞分化为分泌IFN-γ的Th1细胞,促进细胞介导的免疫反应清除细胞内病原体;当局部IL-4存在时,CD4+T细胞分化为分泌IL-4、IL-5和IL-13的Th2细胞,促进体液免疫反应清除细胞外病原体。近期研究发现了CD4+T细胞的一种新的分化方向,在抗原递呈细胞产生的TGF-β1、IL-6和IL-23的共同作用下,分化为Th17细胞,该细胞主要分泌IL-17。Th17细胞在正常免疫反应中的作用尚未知,但研究已发现其在清除特定感染源中发挥重要作用[2-3]。适当的T细胞免疫反应可有效清除病原体并产生记忆性T细胞,不适当的T细胞免疫反应或持续的T细胞亚群激活可导致自身免疫性或过敏性疾病,许多研究已证实过去认为是由Th1细胞介导的许多自身免疫性炎症反应其实是由产生IL-17的Th17细胞介导的。IL-17是分子量为20～30ku的糖蛋白,是早期的炎症因子,具有广泛的生物学活性,它可刺激滑膜细胞、成纤维细胞、角质细胞、上皮及内皮细胞分泌各种细胞因子,如IL-6、IL-8、前列腺素E2、单核细胞化学趋化蛋白-1和粒细胞集落刺激因子等[4]。

荧光实时定量RT-PCR方法作为检测mRNA表达的新技术,具有高灵敏性,实时监测,定量准确等优点,近年来广泛应用于分子学领域的研究[5]。我们采用SYBR-GreenI荧光实时定量RT-PCR法检测寻常型白癜风患者外周血淋巴细胞中IL-17mRNA的表达,该方法在应用过程中需结合熔解曲线分析来确定PCR产物的特异性[6]。本试验通过熔解曲线分析,确定PCR产物特异性好。结果显示进展期白癜风患者外周血淋巴细胞中IL-17mRNA的含量明显高于健康对照,而稳定期的患者IL-17mRNA的水平与健康对照无明显差异,IL-17mRNA与白癜风的病程无相关性,但与白癜风的皮损面积呈正相关,表明IL-17可能参与了白癜风的进展过程,既往研究表明,在白癜风皮损周围有淋巴细胞浸润,局部的炎症因子IL-6、IL-8可对黑素细胞有损伤作用。外周血中炎性细胞因子IFN-γ 、IL-6、IL-8水平升高[7]。IL-17可能通过刺激炎症细胞产生上述炎症因子而对黑素细胞产生损伤,从而导致白癜风的发病,而Th17细胞作为新的细胞亚群,是否参与白癜风的发病,尚需更多的研究。

综上所述,白癜风发病机制目前尚未阐明,我们通过对IL-17mRNA在寻常性白癜风患者中的研究,为白癜风的免疫学发病机制提供了更多的证据,为以后提出新的治疗方法提供路径。

[参考文献]

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[2]McKenzie BS,Kastelein RA,Cua DJ.Understanding the IL-23-IL-17 immune pathway[J]. Trends Immunol,2006,27(1):17-23.

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[5]王梁燕,洪奇华,张耀洲.实时定量PCR技术及其应用[J]. 细胞生物学杂志,2004,26(1):62-66.

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[7]Yu HS,Chang KL,Yu CL,et al.Alterations in IL-6,IL-8,GM-CSF,TNF-alpha and IFN-gamma release by peripheral mononuclear cells in patients with active vitiligo[J].J Invest Dermatol,1997,108(4):527-528.

[收稿日期]2009-12-18[修回日期]2010-01-29

编辑/张惠娟

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