肾癌组织中Wnt5a的表达及其临床意义

[摘要] 目的 探讨Wnt5a在肾癌组织中的表达与病理意义以及对肾癌细胞增殖及侵袭潜能的影响，为寻找肾癌有效的治疗途径及预后判定指标提供依据。 方法 对43例肾癌组织标本和11例正常肾组织标本中的Wnt5a mRNA和Wnt5a蛋白表达水平进行检测，分析肾癌组织Wnt5a mRNA表达与临床病理特征的关系，及Wnt5a蛋白表达与预后的关系。 结果 Wnt5a mRNA和Wnt5a蛋白在肾癌组织中的阳性表达率均显著高于正常肾组织（P < 0.05）。肾鳞癌的Wnt5a mRNA表达水平明显高于肾腺癌（P < 0.01）；低分化组显著高于高分化组（P < 0.01）。Wnt5a蛋白阳性的肾癌患者2年生存率明显低于阴性患者（P < 0.01）。结论 Wnt5a表达水平在肾癌细胞中明显增高，且与肾癌的细胞分化程度、组织类型及预后密切相关，提示Wnt5a可能参与肾癌的发生发展过程。

[关键词] Wnt5a；肾癌细胞；侵袭转移；影响

[中图分类号] R737.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0029-03

肾癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，近年来其发病率呈逐步增高的态势[1]。有研究报道，约有1/5发病的恶性肿瘤为肾癌，在总癌症死亡数中因肾癌死亡的占23.8%[2]。虽然近年来随着各种新手段、新方法、新技术的不断涌现，但有关肾癌患者总生存率方面的研究仍然没有取得实质性的进展。研究发现，Wnt5a的表达与肿瘤细胞侵袭转移显著相关，提示患者短生存期及预后不良。因此，深入研究Wnt5a与肾癌的关系具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南华大学附属第二医院2011年3月～2012年3月收治的43例肾癌患者，其中，男31例，女12例；年龄32～72岁，平均（56.7±4.5）岁；Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期22例。均经手术治疗及病理学确诊，术前未接受放、化疗，均有完整的术后随访记录，生存时间的计算从手术日期到由于复发或转移而死亡的日期或末次随访日期为止，随访期1～24个月。另选取11例非肾癌病例的正常肾组织作为对照，其中，男7例，女4例；年龄30～65岁，平均（50.4±4.8）岁。

1.2 方法

43例肾癌组织标本和11例正常肾组织标本均为手术时获取，所有标本分成两份，一份于无菌条件下采集，并放入经二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的Ep管内，液氮保存，行荧光实时定量RT-PCR，检测Wnt5a mRNA表达水平；一份于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋处理、保存，行Wnt5a蛋白的免疫组化染色。

1.2.1 荧光实时定量RT-PCR检测肾癌组织和正常肾组织Wnt5a mRNA表达

1.2.1.1 标本处理 将50～100 mg组织标本放入Ep管中，剪碎，加入1 mL Trizol，匀浆。

1.2.1.2 RNA分离 吸入1.5 mL Ep管内，室温静置5 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡Ep管15 s后，室温孵育5 min；配平，4℃ 12 000 r/min 离心15 min。

1.2.1.3 RNA沉淀 吸取上层水相，置于另一个1.5 mL Ep管中，加入0.5 mL异丙醇，充分混匀后-20℃ 放置1 h，4℃ 10 000 r/min 离心10 min。

1.2.1.4 RNA清洗 弃上清，加入75%的乙醇1 mL，室温放置5 min；4℃ 10 000 r/min离心10 min，移去上清，吹干、沉淀。

1.2.1.5 RNA再溶解 去乙醇，室温干燥5 min；加入100 μL DEPC处理的ddH2O，取3 μL加3 mL ddH2O，10 μL电泳，其余标本放入-70℃保存。

1.2.1.6 RNA浓度测定 用99 μL DEPC水稀释、混匀，用紫外分光光度计分析、计算RNA浓度。

1.2.1.7 RNA完整性检测 制备1.5%琼脂糖凝胶，行RNA完整性检测。于紫外灯透视下观察电泳结果，应可见3条28 s、18 s和5 s RNA的清晰条带。将完整的RNA样品保存于-80℃冰箱备用。

1.2.1.8 cDNA第一条链合成 取1 μg总RNA应用逆转录试剂盒行逆转录以合成第一条链cDNA，-20℃保存备用。

1.2.1.9 检测 实时荧光定量PCR检测目的基因和内参基因表达。

1.2.2 免疫组化染色检测肾癌组织和正常肾组织Wnt5a蛋白表达

经载玻片处理、石蜡切片、脱蜡、水化后，用3%H2O2孵育10 min，蒸馏水漂洗1 min×3次，PBS浸泡5 min，将抗原微波修复15 min后，室温放置30 min，PBS漂洗1 min× 3次，加入5%～10%山羊血清封闭，室温放置10 min，加入一抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗5 min×3次，加入二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗5 min×3次，加入DAB显色，冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.3 判断标准

Wnt5a mRNA阳性判断标准：RT-PCR产物电泳后在紫外光下出现一条538 bp的荧光条带。Wnt5a蛋白阳性判断标准：细胞内观察到清晰可见的棕黄色颗粒即为阳性显色。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织和正常肾组织Wnt5a mRNA的表达

11例非肾癌病例的正常肾组织中，有5例Wnt5a mRNA呈阳性表达，阳性率为45.4%；而43例肾癌组织中，有34例Wnt5a mRNA呈阳性表达，阳性率为79.1%。肾癌组织中Wnt5a mRNA阳性率较正常肾组织显著增高（P < 0.05）。见表1。

2.2 肾癌组织Wnt5a mRNA表达与临床病理特征的关系

在肾鳞癌组织中，Wnt5a mRNA表达明显升高，与腺癌相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；肾癌组织中，肿瘤细胞分化程度越低，Wnt5a mRNA表达越高，其中细胞分化程度差的Wnt5a mRNA表达较分化程度好的明显增高（P < 0.01）。可见，肾癌组织Wnt5a mRNA表达与组织学类型、细胞分化程度关系密切。见表2。

2.3 肾癌组织和正常肾组织Wnt5a蛋白的表达

11例正常肾组织中，有4例Wnt5a蛋白呈阳性表达，阳性率为36.4%；而43例肾癌组织中，有29例Wnt5a蛋白呈阳性表达，阳性率为67.4%。肾癌组织中Wnt5a蛋白阳性率较正常肾组织显著增高（P < 0.05）。见表3。

2.4 肾癌组织Wnt5a蛋白表达与预后的关系

Wnt5a蛋白阳性的肾癌患者2年生存率为31.1%（9/29），而Wnt5a蛋白阴性的肾癌患者2年生存率则为71.4%（10/14） ，可见Wnt5a蛋白阳性的肾癌患者生存率明显低于Wnt5a蛋白阴性患者，两者比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

3 讨论

基因突变和基因表达失调是肿瘤发生和发展的主要分子机制，是涉及多种基因表达的改变以及多种因素影响的非常复杂的细胞生物学过程，不同的肿瘤细胞、不同的肿瘤发展阶段可以有不相同的细胞生物学机制，即使在同一个肿瘤中，构成肿瘤的细胞也可以有不同的细胞形式和内在分子机制。目前国内外对Wnt5a的研究发现，Wnt5a在不同肿瘤发生及侵袭转移中的作用及其机制不一致[3-5]。

研究显示，在多种恶性肿瘤中Wnt5a多呈现高表达状态，并与肿瘤细胞侵袭转移关系密切[6]，这可以提示患者短生存期及预后不良。有国外学者研究发现，低表达Wnt5a细胞和侵袭力较低的亲代黑色素瘤细胞约呈三角形形状，排列密实，并与基膜有着较少的附着；而高表达Wnt5a细胞能使黑色素瘤细胞的运动性增加，侵袭力增强，细胞形态不规则，排列稀散，并与基膜有着较充分的附着，细胞呈现向外扩展[7]。由其介导的Wnt5a通路激活机制对恶性黑色素瘤的侵袭转移有着非常重要的作用。随着Wnt5a表达的升高，细胞PKC活性也随之增加，黏附性、侵袭力增强，当PKC磷酸化增加达到一定水平后，细胞的活力、侵袭力则保持不变，而使用Wnt5a受体的抗体阻断Wnt通路时，PKC和细胞侵袭力受到抑制，两者关系密切，其改变呈一致性[8]，反之，PKC活性发生增加或抑制也可使得Wnt5a的表达增加或抑制[9]。血管生成与肿瘤转移关系密切，而Wnt信号通路在血管生成及病理学方面起着重要作用，如血管细胞中有Wnt5a、Wnt2、Wnt7a、Wnt蛋白受体Fz和Wntlob等多种Wnt蛋白的表达。研究报道，在胃癌中Wnt5a呈现高表达状态，且与胃癌细胞的黏附、浸润、转移关系密切，这可能与非受体酪氨酸激酶FAK及小GTP结合蛋白Rac被激活有关[10]。另外，在非小细胞肺癌中Wnt5a也呈现高表达状态，尤其是鳞癌，且Wnt5a的表达水平高低关系着肺癌转归及预后，这可能是由于Wnt5a活化信号通路，使上皮间叶样表型转化被促进，从而加快肺癌细胞的黏附、浸润及转移。也有研究发现，在前列腺癌前病变及癌组织中Wnt5a均呈现高表达状态[10]。由Wnt5a介导的Wnt经典及非经典通路与肿瘤细胞侵袭转移关系密切，在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[11-12]。

文献报道，Wnt5a也存在于正常肾组织中，在肾的发育成熟中起着重要作用。目前有关Wnt5a在肾癌发生发展中的作用研究鲜见报道。本研究结果显示，在肾癌中Wnt5a mRNA和Wnt5a 蛋白表达水平均显著高于正常肾组织（P < 0.05）。肾鳞癌的Wnt5a mRNA表达水平明显高于肾腺癌（P < 0.01）；低分化癌细胞的Wnt5a mRNA表达水平显著高于高分化癌细胞（P < 0.01）。说明Wnt5a的过度表达与肾癌病理类型及细胞分化程度密切相关，肾癌分化程度越低，Wnt5a mRNA表达越高，提示Wnt5a可能参与肾癌的发生发展过程[13]。另外，本实验以2年生存时间作为分界，发现Wnt5a蛋白阳性肾癌患者的2年生存率明显低于阴性患者（P < 0.01），表明Wnt5a蛋白的表达水平高低与肾癌患者预后关系密切。Wnt5a蛋白表达水平越高，肾癌患者预后越差；反之，Wnt5a蛋白表达水平越低，则预后越好。

综上所述，肾癌患者中Wnt5a呈现高表达状态，Wnt5a表达与肾癌病理类型、细胞分化程度及预后密切相关，推测Wnt5a高表达及由其介导的Wnt信号转导通路在肾癌的侵袭转移中起着重要作用，其可能参与肾癌的发生发展过程。

[参考文献]

[1] 朱紘萱.骨肉瘤中Wnt5a和Ror2蛋白的表达及其相关性研究[D].长沙：中南大学，2010.

[2] 马力.nm23-H_1基因突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981经典Wnt信号通路调控机制的影响[D].成都：四川大学，2006.

[3] 黄英，刘国祥.Wnt5a与肿瘤发生发展的关系[J].实用癌症杂志，2008，23（5）：529-533.

[4] 贺全勇.HSP70对Wnt5a表达、释放及其促炎功能的影响[D]. 长沙：中南大学，2009.

[5] Zeng ZY，Zhou YH，Zhang WL，et al. Gene expression profiling of nasopharyngeal carcinoma reveals the abnormally regulated Wnt signaling pathway [J]. Hum Pathol，2007，38（1）：120-133.

[6] Shen X，Li D，Li H，et al. Wnt5a signaling——a new and attractive target for specific anticancer therapy[J]. Clin Oncol Cancer Res，2010，7（1）：1-6.

[7] Weeraratna AT，Jiang Y，Hostetter G，et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma [J]. Cancer Cell，2002，1（3）：279-288.

[8] Klaus A，Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer [J]. Nat Bey Cancer，2008，8（5）：387-398.

[9] Bachmann IM，Straume O，Puntervoll HE，et al. Importance of Pcadherin，beta-catenin，and Wnt5a/frizzled for progression of melanocytic tumors and prognosis in cutaneous melanoma [J]. Clin Cancer Res，2005，11（24）：8606-8614.

[10] Nishita M，Enomoto M，Yamagata K，et al. Cell/tissue-tropic functions of Wnt5a signaling in normal and cancer cells [J]. Trends Cell Biol，2010，20（6）：346-354.

[11] Pukrop T，Binder C. The complex pathways of Wnt5a in cancer progression [J]. J Mol Med，2008，86（3）：259-266.

[12] Seifert JR，Mlodzik M. Frizzled/PCP signalling：a conserved mechanism regulating cell polarity and directed motility [J]. Nat Rev Genet，2007，8（2）：126-138.

[13] 牛长春，司维柯，李军，等.稳定过表达Wnt5a对K562细胞生物学性状的影响[J].第三军医大学学报，2009，31（22）：66-67.

（收稿日期：2013-05-20 本文编辑：程 铭）

推荐访问： 肾癌 表达 组织 临床意义 Wnt5a

---