一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

摘要 [目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能，构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体，通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥cDNA为模板，PCR扩增MNB1基因全长，将该基因连接到过量表达载体上；然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101，浸花法转化野生型植株；最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp，酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落，测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株，为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。

关键词 拟南芥；MNB1基因；过表达；转基因植株

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0116-03

Abstract [Objective]In order to further study the function of MNB1 gene in response to cadmium stress in plants， the overexpression vector of MNB1 gene in Arabidopsis was constructed， and the corresponding transgenic plants were finally obtained through screening and identification.[Method] The fulllength MNB1 coding sequence was amplified through PCR from cDNA of Arabidopsis （Col0） using specific primers and cloned into the overexpression vector. Then the resulting construct was transformed into Agrobacterium strain GV3101 for transformation into the Col0 plants by the floral dip method. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification.[Result]The fulllength CDS of MNB1 gene was 1 368 bp， which was identified by enzyme digestion and transformed into E. coli. The positive clones were identified and the sequencing results were completely correct. Positive transgenic plants were obtained by resistance screening and PCR electrophoresis.[Conclusion]The construction of MNB1 gene overexpression vector was successful and the corresponding transgenic plants were obtained， which laid the foundation for further study on the function and molecular mechanism of this gene regulating plant stress response to cadmium.

Key words Arabidopsis thaliana；MNB1 gene；Overexpression；Transgenic lines

随着人口快速增长、工业发展、工厂及生活废弃物的排放以及农业化肥、农用药物等施用量的不断增加，许多有害有毒物质不断进入土壤中，造成土壤重金属污染，已经成为世界性严峻的环境问题之一[1-2]。其中重金属镉是对动植物具有高度毒性的最危险的污染物之一，给生态环境和食品安全带来了严重的威胁。镉暴露可引起肺气肿和骨质疏松症，导致人体肺、肾和骨骼的不可逆损伤[3]。在过量的重金属暴露下，植物也会表现出生物量减少、叶片萎黄、抑制根系生长和形态改变，常常导致植物过度暴露死亡[4]。所以植物对重金属例如镉的耐受性和积累能力在植物修复和粮食安全中的潜在应用激起了人们的兴趣。植物对重金属镉胁迫的响应机制主要包括降低金属生物利用度、控制金属流入、金属螯合、促进金属外排和金属诱导活性氧的解毒等途径。植物通过大量的防御机制，包括复杂的天然免疫系统来保护自己免受各种各样病原体，如细菌、真菌、病毒等的侵害[5]。植物可以区分自我与非我或检测特定的病原体。通过信号介导的防御反应能导致植物细胞壁的固化，生产微生物代谢产物和病理相关蛋白等[6]。信号分子，例如ROS、乙烯、SA和茉莉酸在激活防御机制的复杂信号网络中扮演着重要的角色[7]。

在前期研究的基础上，发现MNB1功能缺失突变体表现出对重金属镉敏感的表型，因此找到MNB1这个基因作为研究目标。已有研究表明所有已知的植物凝集素可以分为12大凝集素家族[8]。植物体中的甘露糖结合凝集素，即MNB，在植物体受到病原体攻击的防御信号传导中起到关键性的作用。笔者拟通过构建MNB1基因过量表达载体，筛选并鉴定得到的转基因阳性植株，以期为进一步研究该基因在植株应对镉胁迫响应中的功能奠定基礎。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料。该试验所用的植物材料是拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚（Columbia，Col）生态型，记作WT（wild-type，Col-0），购自美国拟南芥种子资源中心。载体构建所用质粒pART27，大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101。

1.1.2

主要试剂。Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）；T4-DNA Ligase（TaKaRa）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa）；限制性内切酶Kpn I和Xho I（NEB）；Agar，NaCl，Yeast extract，Tryptone，Gold View，DNA Loading buffer，Marker，dNTPs，异丙醇，氯仿，无水乙醇，75%乙醇，葡萄糖，蔗糖，Silwet L-77，MES，VB5等。

1.2 方法

1.2.1

Trizol法提取植物总RNA。从培养皿或处理液中用大枪头将拟南芥幼苗样品挑出，用滤纸将水分吸干，将样品放入预冷的研钵，加入适量液氮，待液氮快干时立即迅速研磨至样品粉碎。

粉碎后均匀加入1 mL Trizol（存于4 ℃冰箱），尽量使粉末被完全覆盖。每次研磨完一个样品应立即置于冰上。研磨全部结束后室温静置5 min。在超净工作台中向每个样品里快速加入200 μL氯仿，剧烈混匀15 s，可涡旋。室温静置3 min后，13 000 r/min、4 ℃离心15 min。离心结束后，取样时保持离心角度不变，缓缓吸取上清液500 μL至新的EP管中，并做好标记。此时应轻缓地加入500 μL异丙醇，并立即轻轻颠倒混匀6～8次。

室温静置10 min后，13 000 r/min、4 ℃离心10 min。倒掉上清，留取沉淀（尽量倒干净）。沿着管壁缓缓加入1 mL 75%乙醇（事先配好存于-20 ℃），勿吹打沉淀，8 000 r/min、4 ℃离心5 min。重复洗涤1次，倒掉上清，用黄枪头将液体吸取干净，尽量不要触碰到沉淀。在超净台中晾干沉淀，使乙醇完全揮发，约8 min。加入30 μL DEPC水溶解沉淀，并置于60 ℃水浴锅内促进溶解。吸取5 μL样品检测其纯度和浓度。

1.2.2

大肠杆菌的转化。从-80 ℃冰箱中取出感受态细胞，迅速放在冰上解冻融化10 min。取5～10 μL连接产物加入50 μL感受态细胞中（在冰盒中操作，不可吹打，轻轻快速混匀），冰浴30 min。之后42 ℃热激90 s，快速将管取出放在冰上静置5 min。每管加入800 μL无菌液体LB培养基。在摇床上振荡培养，设置280 r/min、37 ℃、45 min。4 000 r/min、离心5 min，弃上清。剩300～500 μL重悬涂布LB固体培养基的平板上，正置30 min吹干，再于37 ℃，倒置恒温培养过夜。取出培养过夜的平板，在超净工作台中挑取单一菌落至LB液体培养基，每个EP管约300 μL，用枪头挑菌。250 r/min、28 ℃振荡培养至培养基浑浊，5 h左右，进行菌落PCR鉴定。

1.2.3 浸花法浸染拟南芥。将-80 ℃保存的菌种在含50 mg/L Spec、50 mg/L Gen的固体培养基上接种培养，并划线，挑取单菌落于500 μL的LB培养基（50 mg/L Spec，50 mg/L Gen）中，28 ℃、220 r/min培养过夜。菌液摇匀后进行PCR鉴定，取阳性菌液200 μL转接到100 mL LB液体培养基（50 mg/L Spec，50 mg/L Gen）中，摇床培养至OD600 为1.2～1.6，于5 000 r/min离心10 min，弃上清，配制浸染缓冲液，重悬沉淀，再次离心，重复1次。加入适量缓冲液，将菌液稀释至OD600为0.5～0.8，再按比例加入Silwet L-77。

用消毒剪去除已授粉的花、果荚，倒置于装有渗透缓冲液的5 mL EP管中浸染20 s，使植株表面浸有一层水膜即可。将整盆野生型植株浸完后，贴上标签做好标记，覆盖保鲜膜以保持湿度，放在纸盒中避光培养，24 h后取下浸染后包上的薄膜，于室温中继续培养。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增

为了验证MNB1基因在拟南芥应对镉胁迫调控中的功能，构建了35S：：MNB1过量表达载体。首先进行目的片段扩增，即克隆MNB1基因。以拟南芥幼苗为材料参照植物总RNA提取方法，提取植物的总RNA，提取时应尽量避免mRNA降解，总RNA中包括mRNA、tRNA和rRNA，利用其中mRNA反转录获得植物的cDNA。再以cDNA为模板扩增所需目的基因，结果见图1。由图1可知，获得的基因片段与预期大小一致，所需目的片段大小为1 368 bp。

2.2 过表达载体的连接与转化

为构建MNB1的35S过表达载体，通过2种限制性内切酶Kpn I和Xho I分别酶切目的片段和pART27质粒载体，该试验所用的pART27为改造过的质粒，质粒上加入Kpn I及Xho I酶切位点。酶切后进行电泳检测，酶切后基因和载体条带清晰、大小正确，方可用于下一步试验。将酶切过的基因和载体用T4连接酶进行连接，并用热激法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养过夜后如图2所示。由图2可知，初步通过抗性筛选获得了重组质粒单菌落，有待下一步鉴定。

2.3 阳性重组质粒的PCR鉴定

为检验克隆的MNB1基因序列信息是否正确和MNB1是否连接到重组质粒上，用含相应抗生素（该试验中使用壮观霉素）的LB平板筛选阳性单克隆，菌落生长情况如图2所示。再进行菌落PCR，任意挑取7个单菌落，在装有800 μL LB（含100 μg/mL壮观霉素）的1.5 mL离心管中37 ℃培养4 h左右。取1～2 μL上清液作模板进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，结果见图3。除了5号菌落，其他6个单菌落都是阳性重组质粒。将图3中1号菌液送到测序公司测序。测序结果通过NCBI blast比对后显示，克隆到的MNB1基因序列完全正确，说明过表达载体构建成功。

2.4 轉基因株系的抗性筛选与鉴定

将测序正确的质粒电击转化到GV3101农杆菌菌株，用含有50 μg/mL壮观霉素和50 μg/mL庆大霉素的LB固体培养基，筛选鉴定阳性克隆，挑取单菌落进行菌落PCR验证，用转化成功的农杆菌通过浸花法浸染野生型植株，收种。将收获的种子干燥春化后撒到含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS 平板上正常培养14 d，生长出正常的真叶与根，挑取生长嫩绿且有根的幼苗进行移栽，抗性筛选结果如图4所示。

移栽的植株培养到21 d左右时，剪取MNB1转基因植株叶片，提取基因组DNA。PCR鉴定MNB1转基因阳性株系，PCR鉴定电泳结果如图5。由图5可知，抗性筛选得到的植株都是转基因阳性植株，都成功地过量表达了MNB1基因，这表明过表达载体构建以及转基因株系的筛选与鉴定都获得了成功。

3 结论与讨论

重金属通过在食物链和饮用水中积累，对人体健康和环境造成潜在威胁[9-10]。利用现代分子生物学手段，植物修复技术治理土壤中重金属污染，以及从源头上控制农产品食品质量安全具有重大意义。该试验自拟南芥种质资源中心获得了拟南芥MNB1基因功能缺失型突变体，在前期试验基础上发现该突变体对镉胁迫表现敏感。于是通过基因工程技术构建了MNB1过量表达载体，并通过浸花法转入野生型植株中，筛选得到转基因植株，并进一步进行筛选与鉴定，最终获得了MNB1过表达转基因阳性植株。这为对MNB1基因调控植物镉耐受的机理做进一步深入研究奠定了基础，是一项十分有意义的研究性课题。

参考文献

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