秸秆还田对植烟土壤酶活性及细菌群落多样性的影响
时间：2022-04-09 08:33:19 浏览次数：次
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摘要：为明确秸秆还田的烟田土壤微生态效应，通过3年定位试验研究了不同用量小麦及玉米秸秆还田对植烟土壤酶活性及细菌群落多样性的影响。结果表明，秸秆还田可不同程度提高土壤蔗糖酶、碱性磷酸酶及脲酶活性。玉米秸秆还田的土壤蔗糖酶和碱性磷酸酶活性高于等量小麦秸秆还田处理。与对照相比，玉米及小麦秸秆中低量（4500及1500 kg/hm2）还田后土壤的细菌群落多样性下降，而高量（7500 kg/hm2）还田后则不变或稍有增加。此外，高量玉米秸秆还田与其他处理间的土壤细菌群落相似系数仅为0.57，表明其群落结构变化较大。而且低、中、高量玉米秸秆还田土壤DGGE图谱中的特异条带分别属于乳酸球菌（Lactococcus）、不可培养细菌（Uncultured bacterium）及硝化螺菌（Nitrospira）。可见，两种秸秆还田均能提高植烟土壤的蔗糖酶、碱性磷酸酶和脲酶活性，且玉米秸秆在高量还田后可增加土壤细菌群落的丰度及多样性。
关键词：秸秆还田；植烟土壤；酶活性；细菌群落多样性
中图分类号：S572.062文章编号：1007-5119（2017）01-0053-06DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.009
Abstract：In order to understand the soil micro-ecological effects of different straw returning in tobacco fields，a three-year field trial was conducted to study the effect of different amount of wheat straw and maize straw returning on soil enzyme activities and soil bacterial community diversity. The results indicated that the activities of soil invertase， alkaline phosphatase and urease were all promoted in a certain degree by straw returning. The activities of soil invertase and unease in maize straw returning were higher than those in wheat straw returning at the same amount. The soil bacterial communities were both decreased in low （1500 kg/ha） and middle （4500 kg/ha） amount of maize and wheat straw retuning compared with CK， while they remained unchanged or increased slightly in high （7500 kg/ha） amount of straw returning. The similarity coefficient of soil bacterial communities between the 7500 kg/ha maize straw retuning treatment and other treatments was only 0.57， which indicated that its soil bacterial community structure changed greatly. Furthermore， some specific bands were found in DGGE band spectrums with low， middle and high amount of maize straw returning.They were identified as Lactococcus， Uncultured bacterium and Nitrospira individually by band cloning and sequencing. In total， both of maize and wheat straw returning could improve soil invertase， alkaline phosphatase and urease activities. High amount of maize straw could increase the richness and diversity of soil bacterial communities in tobacco planting fields.
Keywords：straw returning； tobacco planting field； soil enzyme activity； soil bacterial community diversity
黃淮烟区是我国传统的优质烟叶产区，近年来由于大量化学肥料的施用，有机物料投入不足，导致了烟田土壤出现板结和酸化、有机质下降、养分失调等一系列土壤退化问题，这在一定程度上制约了土壤质量及烟叶品质的提升[1]。与此同时，黄淮烟区作为两年三熟制粮食作物的主产区，每年产生的大量小麦及玉米秸秆常被闲置或焚烧，极易造成资源的浪费及严重的环境污染问题。而秸秆本身作为一种重要的有机物料，合理还田后不仅能够增加土壤有机质，改良土壤结构，而且能促进土壤微生物的生长繁殖，改善土壤微环境[2]。因此，开展秸秆在烟田的还田工作，不仅能够促进当地有机物料的资源化利用，有效减少大气污染，而且在改良烟田土壤、发展循环烟草农业方面具有重要意义。
土壤微生物作为维持土壤质量的重要组成部分，能够促进土壤中营养物质的转化、有机质的合成分解及土壤结构的稳定性[3-4]。土壤微生物的分布及群落结构变化不仅敏感反映土壤环境的变化，也是土壤生物活性的具体反映[5]。土壤酶作为土壤生态系统中生物化学反应的催化剂，是物质循环及能量流动过程中最活跃的物质之一[6]，土壤酶活性与土壤理化性质、肥力状况及农田管理措施等密切相关，可在一定程度上反映土壤微生物活性及土壤质量。作物秸秆还田在改善土壤理化性质的同时，能激发和调控土壤微生物组成及各种酶活性，而且土壤的微生态特征随秸秆物质组成、还田数量及还田方式的不同而变化[7]。
目前，有关秸秆还田对农田土壤养分、微生物及作物产量方面的研究较多[8-10]，但不同秸秆定位还田对植烟土壤微生态效应的研究还少见报道。本文通过分析不同用量玉米及小麦秸秆还田对植烟土壤酶活性及细菌群落多样性的影响，探究适宜黄淮烟区烟叶生产条件的秸秆种类及用量，旨在为改善当地土壤微环境、提升土壤生产力、促进烟草农业的可持续发展提供理论依据及实践指导。
1 材料与方法
1.1 试验区概况
试验地点位于山东省诸城市百尺河乡大顺河
村（36°9′N，119°32′E），地处温带季风性气候区，无霜期191 d，年平均降水量799.7 mm，日照时数为2578.6 h。土壤类型为棕壤。试验前烟田土壤的基本理化性质：pH 6.04，全氮0.7 g/kg，全磷5.3 g/kg，全钾18.7 g/kg，碱解氮55.29 mg/kg，有效磷32.45 mg/kg，速效钾213.3 mg/kg。
1.2 试验设计
秸秆还田定位试验于2009—2012年开展，品种为中烟100，连续3年种植。试验共设7个处理，分别为玉米秸秆还田1500 kg/hm2（M1）、4500 kg/hm2（M2）、7500 kg/hm2（M3），小麦秸秆还田1500 kg/hm2（W1），4500 kg/hm2（W2），7500 kg/hm2（W3）和对照处理（CK）。试验采取随机区组设计，每个处理3次重复。小麦和玉米秸秆均在每年3月份土地翻耕前，粉碎后撒施于土壤表面，然后翻耕耙匀。小麦秸秆的氮、磷、钾含量分别为0.61%、0.17%、0.97%，玉米秸秆的氮、磷、钾含量分别为0.87%、0.16%、1.2%。试验田的施肥情况为：施用烟草专用肥[m（N ）：m（P2O5）：m（K2O）= 10：10：20]750 kg/hm2，硫酸钾225 kg/hm2，腐熟豆饼300 kg/hm2。
1.3 样品采集与分析
1.3.1土壤样品采集与处理在2012年烟叶采收结束后，进行耕层土壤取样。每个小区采用5点法混合取样，用冰盒带回实验室，过2 mm筛处理后，一部分土样自然风干后进行土壤酶活性测定。另一部分放入-20 ℃冰箱中，分析土壤细菌群落多样性。
1.3.2土壤酶活性测定土壤的蔗糖酶、脲酶及碱性磷酸酶活性均采用比色法，过氧化氢酶采用滴定法，所有酶活性均参照文献[11]的方法进行测定。
1.3.3土壤细菌群落多样性测定（1）土壤细菌总DNA提取：采用Fast DNAR SPIN Kit For Soil（MP bio公司）试剂盒提取并纯化，具体方法参照操作说明进行。
（2）PCR-DGGE：土壤细菌的PCR扩增采用细菌通用引物对341F-GC和907R进行。PCR和DGGE的条件采用文献[12]的方法。
（3）特异条带测序分析：对DGGE图谱中的特异性条带进行切胶回收，对切胶回收的DNA再次进行PCR扩增、确认并纯化后，送上海英俊生物技术公司进行测序分析。用BLAST 软件进行细菌同源性比对后，利用MEGA4.0软件进行分析，并通过邻接法构建系统进化树[13]。
（4）细菌群落多样性分析：利用Quantity One（4.2.3）软件对得到的DGGE指纹图谱进行数字化處理，并利用处理结果计算土壤细菌群落的丰富度（S）、均匀度（Eh）及香农-威纳（H"）指数，以此来表征土壤细菌群落结构多样性的变化[14]。
1.4 数据处理
试验数据采用SAS 9.3和Excel 2007软件进行统计分析和作图，用LSD法进行多重比较，所有统计学显著差异水平设为α=0.05。
2 结果
2.1 秸秆还田对植烟土壤酶活性的影响
秸秆还田对4种土壤酶活性的影响如表1所示，土壤的蔗糖酶、碱性磷酸酶及脲酶活性均随着秸秆还田量的增加呈增加趋势。蔗糖酶活性中除W1处理外，其他处理均与CK差异显著，脲酶活性中除M1和W1处理外，其他处理均与CK差异显著。碱性磷酸酶活性中各秸秆还田处理均与CK差异显著。而且玉米秸秆还田的蔗糖酶、脲酶及碱性磷酸酶活性均高于等量的小麦秸秆还田处理。
与其他3种土壤酶活性不同，过氧化氢酶活性没有随秸秆还田量增加呈现一致的规律性，而且低中量小麦秸秆还田的过氧化氢酶活性要高于等量玉米秸秆还田处理。总之，秸秆种类及还田量均对烟田土壤的酶活性产生重要影响。
2.2 秸秆还田对土壤细菌多样性的影响
2.2.1土壤细菌的DGGE图谱分析各处理土壤细菌的DGGE图谱如图1所示，图谱中各处理的条带数目不同，且条带的迁移率和强度亦存在明显差异。不同秸秆还田处理中存在许多相同或相异的条带，而且部分条带间的亮度存在差异，表明这些处理土壤中存在共有及特异的土壤细菌，而且细菌群落的丰富度及多样性存在一定差异。其中M1处理的DGGE指纹图谱的亮度及条带数目明显少于其他处理，而W3处理图谱的亮度及条带数要明显多于其他处理，均直观表现了不同秸秆还田处理后土壤细菌群落的差异。
2.2.2秸秆还田的土壤细菌多样性分析土壤细菌群落多样性分析如表2所示，M3处理的丰富度（S）和香农-威纳指数（H"）最高，分别是33和3.40；而M1处理相对最低，分别为25和3.17。均匀度（Eh）以M2处理最高，为0.996，M3处理最低，为0.860。总体上，土壤细菌群落的丰富度及香农-威纳指数均随秸秆还田量的增加而增大。但与CK相比，小麦秸秆M1及M2处理的土壤细菌丰富度及多样性指数有所下降，而玉米秸秆W2及W3处理则变化不大。此外，在低中量秸秆还田条件下，等量秸秆还田处理的细菌丰富度及多样性指数表现为M1
2.2.3土壤细菌群落的相似性分析土壤细菌的UPGMA聚类分析结果表明（图2），秸秆还田各处理的土壤细菌群落可分为3个族群，M3为第1个族群；M1为第2个族群；M2、CK、W3、W1、W2为第3个族群。其中W3与CK、W2与W1间的土壤细菌群落的相似性最高，相似系数均大于0.85。M3与其他处理组成的一大类细菌群落间的相似系数最低，仅为0.57。一般认为相似系数大于0.60的两个群体才具有较好的相似性。因此，除M3处理外，M2、CK、W3、W1、W2及M1处理的土壤细菌群落的相似程度均较高，表明土壤细菌群落结构间的差异性较小。
2.2.4土壤细菌DGGE条带的系统发育分析对DGGE指纹图谱中回收的7条特异性条带进行克隆测序并构建了系统发育树（图3），其中条带1、3、6、7为秸秆还田各处理土壤共有的条带，条带2为M3处理特有条带，测序结果显示为硝化螺菌（Nitrospira），是一种可利用无机氮源进行硝化作用的化能自养型细菌。M1处理中出现的特异性条带5为乳酸球菌（Lactococcus），是一种兼性厌氧的革兰氏阳性球菌。M2处理出现的特异性条带4为不可培养细菌（Uncultured bacterium HE647148.1）。所测序的7个条带中不可培养细菌比例约占71.42%，而可培养细菌较少。
3 讨论
本研究发现，小麦及玉米秸秆还田各处理均不同程度地提高了土壤脲酶、转化酶、磷酸酶活性，这与王灿等[15]研究結果一致。秸秆还田可为土壤微生物活动提供丰富的碳源，从而增加土壤微生物种类、数量及活性，而这又在某种程度上决定着土壤酶的来源[16]。但过氧化氢酶的活性与其他酶活性不同，一方面，这可能与过氧化氢酶的辅基受到化肥中阴离子的封阻有关[11]，氮肥有抑制过氧化氢酶活性的作用[17]。另一方面，也可能与本试验连续3年的烟草连作种植有关，张伟等[18]发现短期连作产生的某些自毒物质对土壤生物化学过程有抑制作用，能够降低土壤中的过氧化氢酶活性。可见，不同秸秆还田后土壤氧化氢酶活性差异的原因及机制还需要进一步研究。
秸秆还田能够改变土壤pH及C、N养分等土壤化学性质，从而间接影响土壤微生物的群落结构。我们前期研究发现，随秸秆还田量的增加，烟田土壤pH有降低趋势[19]，这主要与秸秆物质在分解过程中产生的有机酸有关[20]。而随着秸秆还田年限的增加，土壤pH呈下降趋势，同时土壤微生物群落的多样性也呈下降趋势[21]。此外土壤微生物的多样性与秸秆分解后土壤中的碳源养分具有较好相关性，一般土壤中碳源多，其微生物活性及多样性就高。在本研究中，与CK相比，低中量秸秆还田（M1、M2、W1）的土壤细菌群落多样性有所降低，一方面可能与秸秆还田导致土壤pH的下降有关；另一方面低量的秸秆还田虽然能增加碳源，但不足以造成土壤有机质的显著增加[19]。而随着秸秆还田量的继续增加，土壤细菌群落的多样性增加且稍高于对照。因为高量秸秆还田（W3、M3）会显著增加土壤有机质含量，调节土壤C/N比，创造出更适宜微生物生长繁殖的微环境。此外，玉米及小麦秸秆由于自身的腐解特点及碳氮含量差异，也会影响到土壤的碳氮养分及微生物的生存条件[22]，从而导致土壤细菌群落多样性的差异。
DGGE指纹图谱中存在的许多共有条带，说明土壤细菌中的优势菌群在植烟土壤中较稳定，受秸秆种类及其还田量的影响较小。在玉米秸秆还田中，M3处理中土壤细菌DGGE条带2的亮度最大，说明7500 kg/km2的玉米秸秆还田后，促进了植烟土壤中的优势菌群-硝化螺菌（Nitrospira）的生长与繁殖，而硝化螺菌能够将土壤中的亚硝酸盐转化成硝酸盐，供植物生长需要。这可能是高量秸秆还田改善土壤微环境后的反馈反映。而在玉米秸秆还田M1及M2处理中，分别出现未知的不可培养细菌群落及乳酸球菌（Lactococcus）。而且除M3处理外，其他各处理土壤细菌群落的相似性均较高。可见，中低量的秸秆还田虽然一定程度上影响土壤细菌群落的多样性，但与CK相比其多样性变化较小。后期应继续跟踪分析，以探究土壤细菌群落多样性及特异性菌群对秸秆还田的响应机制，并进一步结合烟田生态环境及烟叶产质量数据，为黄淮烟区制定科学合理的秸秆还田策略。
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