寒冷应激对新疆阿勒泰羊脂肪酸合成酶mRNA表达的影响

摘要：为了研究寒冷应激对阿勒泰羊脂肪酸合成酶 mRNA表达的影响，在寒冷应激前后分别采集湖羊及阿勒泰羊各个部位的组织，采用RT-PCR方法检测各组织中肪肪酸合成酶（Fas） mRNA表达水平，分析在不同品种、不同部位寒冷应激后其表达的变化。结果显示，阿勒泰羊及湖羊Fas mRNA表达量在应激后均有下降，阿勒泰羊尤为显著，且应激后尾部和颈部冷表达量最低。研究表明，在寒冷应激下脂肪酸合成减少，脂肪作为能源物质被分解供能并维持体温的恒定，以适应冷刺激。

关键词：寒冷应激；脂肪酸合成酶；阿勒泰羊；湖羊；mRNA表达水平

中图分类号： S826.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0028-03

应激于1936年由加拿大病理生理学家 Selye首次提出，并定义为机体对外界或内部的各种异常刺激所产生的非特异性应答反应的总和。对动物而言，环境的冷热、创伤、惊吓都属于应激刺激。不同的应激源产生的神经内分泌系统的调节机制和机体所产生的生物学效应不同。而冷应激是高寒地区最普遍的应激源之一，新疆阿勒泰地区位于中国西北边陲，冬季长达半年，温度最低可达-40 ℃，四季不分明，只有冷暖差别。许多优良绵羊品种无法适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，而阿勒泰羊以其抗寒性强、耐粗饲等特点，成为当地的优良类群[1]。

肪肪酸合成酶（fatty acid synthase，Fas）是脂肪合成的关键酶之一，它参与长链脂肪酸合成的一系列反应，最后生成棕搁酸。动物机体中脂肪合成和沉积所需的脂肪酸大部分都来源于脂肪酸的从头合成，即乙酰辅酶A（CoA）和丙二酸单酰CoA在Fas的催化下合成脂肪酸的过程，进而脂肪酸与甘油合成甘油三脂，Fas在机体组织中的表达量和酶的活性对脂肪酸的合成和脂肪的沉积具有决定性作用[2-3]。

新疆阿勒泰羊全身肌肉丰满肥硕，尾根附近沉积大量脂肪，能够适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件。笔者所在实验室前期的研究证实，阿勒泰羊的脂肪酸代谢对体温降低的适应很敏感，为了研究其脂肪组织在抗寒中的重要性，确定其在寒冷的环境下是否作为主要的能源物质参与产热以维持温度的恒定，本试验采用实时荧光定量方法检测寒冷应激前后阿勒泰羊和湖羊各部位脂肪组织Fas mRNA 的表达量，旨在从低温对不同品种绵羊脂肪组织的合成方面分析阿勒泰羊耐寒的可能适应机制，为新疆绵羊抗寒育种工作提供理论依据，减少寒冷应激对养羊业带来的损失。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

选择新疆福海县健康成年的阿勒泰羊和湖羊各5只，在寒冷应激前（10月）和寒冷应激后（1月）分别采集湖羊及阿勒泰羊颈部肌间脂肪、胸部肌间脂肪、腹部肌间脂肪、腿部肌间脂肪、尾部脂肪以及肝脏等6个部位的组织，立即放入液氮罐速冻，转入-80 ℃冰箱中进行保存。

Trizol、DEPC、DNA Marker、mix、质粒提取试剂盒（批号：DP103-02）购自天根生物科技服务有限公司；PrimeScriptRT reagent kit反转试剂盒（批号：RR047A）、pMD18-T Simple Vector、SYBR Premix Ex TaqTM kit试剂盒购自TaKaRa公司（批号：DRR420A）；DNA凝胶回收试剂盒（批号：DP209-02）；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购自北京华美生物工程公司；感受态细胞大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α为笔者所在实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中已发布的绵羊Fas基因为模版（登录号：AF479289.1）用 Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京六合华大基因有限公司合成。上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′，目的片段长度为256 bp。

1.2.2 RNA的提取 利用TRIZOL一步法提取试验样品的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-70 ℃保存备用。然后依次加入以下试剂：RNA 1 μg，10× Reaction buffer 2 μL，MgCl2 1 μL，DNase Ⅰ-RNase-free 1 μL，DEPC处理水补足10 μL，除去存在的少量基因组 DNA。37 ℃反应 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃ 孵化10 min，即可用此RNA作为反转录的模板。以RNase-free水为对照，用紫外分光光度计测定D260 nm/D280 nm的值和总RNA浓度。

1.2.3 反转录 向提取纯化好的各组织总RNA中加入以下试剂：5× gDNA Eraser bufferⅠ2 μL，5× gDNA EraserⅠ1 μL，总RNA 1 μL，无核酸酶水补足至10 μL。42 ℃孵育混合物3 min，冷却后，向下旋转混匀，将管子放回冰上。再向以上反应液中按指定顺序加入如下试剂：无核酸酶水Ⅰ4 μL，5×prime sclipt buffer 2 4 μL，RT Prime MixⅠ1 μL，prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL，终体积为20 μL。加完样后轻柔混合，短暂离心后37 ℃孵育混合物30 min，最后85 ℃加热5 s 终止反应。反转录产物可直接用于PCR扩增，或于-20℃下保存（

1.2.4 目的基因PCR反应及克隆测序 利用常规PCR反应对组织样品中Fas基因进行扩增，PCR反应体系为：Taq DNA聚合酶1.5 μL，10 pmol/L上下游引物各1 μL，10×缓冲液（含Mg2+） 2 μL，2.5 μmol/L dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，超纯水补足到20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸 5 min，用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用常规PCR反应对组织样品中Fas基因进行扩增，将目标片段分别从琼脂糖凝胶中切下，按照DNA回收试剂盒说明回收目标片段，在T4 DNA连接酶作用下，经16 ℃过夜连接pMD18-T载体，用CaCl2法将连接产物转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性菌落后，挑取单菌落进行培养，然后从菌液中提取质粒，菌液送往上海华大基因公司测序。

1.2.5 实时定量PCR反应 提取重组质粒pMD18-T-Fas，将线性化纯化后质粒用紫外分光光度计测定D260 nm、D280 nm，按下式计算拷贝数：

拷贝数（拷贝/mL）=（质粒浓度×6.02×1023）/（649×重组质粒长度）。

式中：6.02×1023为阿氏常数；649为质粒分子质量为1个碱基的平均分子质量。

将重组质粒浓度稀释为1010拷贝数后，在依次稀释为 108、107、106、105、104、103、102、10，以不同浓度的质粒为模板，进行荧光定量PCR反应，反应体系：SYBR 10 μL，ddH2O 7.2 μL，10 pmol/L上下游引物各0.4 μL，模板 2 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，50个循环。

反应结束后，计算机自身会根据质粒浓度与cDNA模板的浓度制作标准曲线。通过此标准曲线来计算质粒浓度。应用MX3000P荧光定量PCR仪进行表达分析。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测阿勒泰羊和湖羊的Fas mRNA表达量 对寒冷应激前后阿勒泰羊及湖羊的颈部肌间脂肪、胸部肌间脂肪、腹部肌间脂肪、腿部肌间脂肪、尾部脂肪和肝脏组织进行实时荧光定量PCR，每个组织进行3次重复。

1.2.7 数据分析 所测不同样本的质粒浓度换算成拷贝数，用SPSS 11.0软件进行分析，用t检验确定Fas基因的表达量，根据单因素方差分析寒冷应激前后与物种间的相关性。

2 结果与分析

2.1 提取总RNA

总RNA的质量是获得完整cDNA序列的关键因素。用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，28S和18S RNA带型清晰可见，表明总RNA无降解，完整性较好（图1）。提取的总RNA经紫外分光光度计测定后D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之间，表明提取的总RNA无蛋白质和苯酚污染，纯度较高，可用于后续的试验。

2.2 Fas基因的RT-RCR扩增

提取湖羊和阿勒泰羊各组织的RNA，采用分光光度计对其进行定量并调整至相同剂量。以RNA反转录的cDNA为模板，以Fas的上、下游引物扩增，得到256 bp的条带（图2）。可以看出，各组织的PCR扩增条带亮度基本一致，说明各个组织的cDNA模板扩增稳定。

2.3 Fas基因的mRNA组织表达水平的绝对定量分析

2.3.1 标准曲线的生成 LightCycle根据所测的质粒浓度自动绘制出标准曲线（图3至图5），测得Fas基因的值几乎在一条直线上，相关系数是0.998 6，曲线的斜率为-3.274，Fas基因的扩增效率为E=10-1/-3.27-1=1.02，而扩增产物的熔解曲线出现了1个主峰，Tm值为（92±0.2）℃；说明所建立的绵羊Fas mRNA定量检测方法是有效的。

2.4 阿勒泰羊与湖羊在应激前与应激后Fas mRNA在不同组织中的表达量分析

阿勒泰羊在应激后各个部位组织的Fas mRNA表达量均有下降，其中阿勒泰羊的颈部、胸部、腹部、腿部肌间脂肪及尾部脂肪的表达量与应激前差异极显著（P<0.01）（图6）。

湖羊在应激后各个组织的Fas mRNA表达量均有下降，其中颈部肌间脂肪、 胸部肌间脂肪、腿部肌间脂肪Fas mRNA

表达量与应激前相比差异显著（P0.05）（图6）。

阿勒泰羊各组织在应激前的Fas mRNA表达量均高于湖羊，而两者在应激后颈部、胸部、腿部肌间脂肪的表达量差异不显著，腹部肌间脂肪和尾部脂肪相比差异显著（P

3 结论与讨论

机体通过协调控制有关脂肪合成和分解的酶的活性和基因表达来调节体脂的沉积，使动物体脂的沉积始终处于一个动态平衡，Fas是体组织脂肪酸再生能力的主要限速酶，在动物体脂沉积中发挥重要作用，其表达水平的升高能够显著增加甘油三酯在体内的沉积[4]。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，Lpl）是脂质代谢中的关键酶[5]，对脂肪沉积具有反作用，主要功能是水解极低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM）中的甘油三酯（TG），使之转变为小分子量的脂肪酸，以供各种组织贮存和利用。

本试验通过对寒冷应激前后阿勒泰羊和湖羊不同组织Fas mRNA的检测发现，各组织的Fas的表达量均呈现下降的趋势；同时，本试验前期研究得出寒冷应激后Lpl在阿勒泰羊和湖羊各组织的表达量均显著升高，其结果可在一定程度上反映机体脂质代谢的规律，在寒冷应激前Fas表达量较高，促进脂肪沉积；Lpl的表达量较低，阻止了脂肪酸进入脂肪组织沉积，脂肪组织把多余的能量转变成脂肪储存起来。而寒冷应激后Fas和Lpl表达量与寒冷应激前相反，机体分解脂肪用以供能并维持体温的恒定。

多数研究表明，热应激可以增加脂肪沉积的趋势[6-7]，动物的体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的全程合成[3]。刘梅等研究了急性热应激对肉仔鸡Fas mRNA表达的影响，发现急性热应激显著增加了肝脏Fas mRNA相对表达水平，从而促进了肝脏的脂肪酸合成，同时急性热应激对腹脂Fas表达量影响并不显著[8]。其结果与本试验结果相反，应激源的相对性和不同物种之间脂肪代谢的调节机理也不一致。对于寒冷应激对脂肪代谢的研究较少，由本试验结果可推断，在寒冷应激下脂肪酸合成减少，脂肪作为能源物质被分解供能，来适应冷刺激。同时，仔鸡的肝脏是胴体脂肪酸合成的主要场所，90%胴体脂肪在肝脏中合成[9-11]，而绵羊的脂肪组织是胴体脂肪合成的唯一场所，因此阿勒泰羊与湖羊肝脏Fas mRNA表达量比脂肪组织低。

本试验选用新疆耐寒品种阿勒泰羊和不耐寒品种湖羊作为试验对象，全面系统地研究了低温条件下2种绵羊机体内脂肪组织参与能量代谢的变化过程，比较其脂肪酸合成酶和脂蛋白脂酶在不同品种之间的表达差异，揭示了阿勒泰羊耐寒的可能适应机制，为新疆绵羊抗寒育种工作提供理论依据。

参考文献：

[1]李金保，别克·木哈买提，库拉西，等. 地方良种阿勒泰羊[J]. 新疆畜牧业，2008（1）：31-33.

[2]Semenkovich C F. Regulation of fatty acid synthase （FAS）[J]. Progress in Lipid Research，1997，36（1）：43-53.

[3]Smith S，Witkowski A，Joshi A K. Structural and functional organization of the animal fatty acid synthase[J]. Progress in Lipid Research，2003，42（4）：289-317.

[4]张力莉，徐晓锋. 动物脂肪酸合成酶基因表达调控的研究进展[J]. 畜牧与兽医，2012，44（4）：101-103.

[5]Goldberg I J，Soprano D R，Wyatt M L，et al. Localization of lipoprotein lipase mRNA in selected rat tissues[J]. Journal of Lipid Research，1989，30（10）：1569-1577.

[6]王启军，卢庆萍，张宏福. 高温环境对北京油鸡生产性能及脂肪沉积的影响[J]. 广东饲料，2006，15（6）：38-40.

[7]贺 喜，戴求仲，张石蕊，等. 日粮共轭亚油酸对两个品种肉仔鸡生长性能及脂类代谢的影响[J]. 动物营养学报，2007，19（5）：581-587.

[8]刘 梅. 急性热应激对肉仔鸡生长性能及脂肪代谢的影响[J]. 动物营养学报，2011，23（5）：862-868.

[9]姚国佳，单体中，汪以真，等. 脂肪酸合成酶基因在皮下脂肪中表达及其与血清Leptin的关系[J]. 农业生物技术学报，2006，14（5）：818-819.

[10]乔 永. 湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积相关基因表达的发育性变化研究[D]. 南京：南京农业大学，2007.

[11]Qiao Y，Huang Z G，Li Q F，et al. Developmental changes of the FAS and HSL mRNA expression and their effects on the content of intramuscular fat in Kazak and Xinjiang sheep[J]. Journal of Genetics and Genomics，2007，34（10）：909-917.贾晓旭，陆俊贤，唐修君，等. 德化黑鸡线粒体DNA控制区全序列测定及起源研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：31-32.

推荐访问： 阿勒泰 羊脂 应激 新疆 合成

---