海金沙内生真菌多样性的研究

摘要：试验从海金沙的根、茎、叶器官中分离获得了内生真菌17株，鉴定出16株，另外1株因不产孢子而未被鉴定出，分别属于3个纲4个目5个科8个属。在鉴定的8属内生真菌中，以青霉属为优势属，占总株数的23.5%，其次是顶枝孢属和链格孢属，各占总株数的17.6%。表明海金沙不同部位、不同季节内生真菌的数量、分布、种群及其组成存在差异，体现了内生真菌生态分布的多样性。

关键词：海金沙；内生真菌；多样性

中图分类号：Q949.36+7.2；Q948.12+2.3；Q346+.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）04-0865-03

Study on the Diversity of Endophytic Fungi of Lygodium japonicum

GAN Jin-lian，PENG Qin，ZHAN Shou-fa，FAN You-fu，CHEN Ye

（College of Life Science， Jiujiang University， Jiujiang 332000，Jiangxi，China）

Abstract： 17 strains of endophytic fungi were firstly isolated from root， stem and leaf tissues of Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.， of which 16 strains were identified belonging to 8 genera， 5 families， 4 orders， 3 classes； and one strain had not been identified owing to lack of spores. Among the 8 genera of identified endophytic fungi， Penicillium Link ex Fr. was the dominant genera， accounting for 23.5% of the total number； the second were Acremonium Link and Alternaria Nees ex Fr.， each of which was comprised 17.6% of the total number. Quantity， distribution， and population constitution of endophytic fungi in L. japonicum varied in different tissues of the plants collected in different seasons， which reflected the ecological diversity of endophytic fungi in L. japonicum.

Key words： Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.； endophytic fungi； diversity

植物内生真菌（Endophytic fungi）是指那些经过长期协同进化，其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织内，而且不会引起宿主产生可见病症的真菌。植物内生真菌与宿主植物在长期的生态系统演化过程中形成了互惠共生关系，内生真菌能产生与宿主相同或相似的生物活性物质，既具有促进植物生长、增强抗病能力、提高抗逆性等作用，又具有医学上抗肿瘤、抗微生物等对人类有利的生物功效，因而在人们的生产与生活中具有重要的应用价值。

海金沙[Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.]系海金沙科（Lygodiaceae）海金沙属（Lygodium Sw.）多年生蕨类植物，主产于广东、江苏、浙江、湖南、湖北、四川、陕西、甘肃等省[1]。海金沙多生于阴湿山坡灌丛中或路边林缘旁，以全草或者干燥成熟的孢子入药，味甘淡，性寒，有清热解毒、通淋止痛、利胆消肿的功效，为治疗泌尿系统感染、尿路结石、肾炎水肿、感冒发热、肠炎，痢疾、癌症等疾病的常用中草药[2-5]。海金沙的化学成分主要有海金沙素、反式-对-香豆酸、咖啡酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、十六碳烯酸，亦含脂肪油、氨基酸、黄酮、多糖等物质[6-13]，因此海金沙植物资源的开发利用备受关注。但目前有关海金沙内生真菌的研究鲜见，而且由于对海金沙自然资源的不合理开发所造成的资源匮乏和环境破坏已成为亟待解决的问题。试验通过对海金沙内生真菌多样性的研究，旨在寻找替代海金沙的新药源，为采用微生物发酵技术生产具有抗肿瘤活性的有效成分物质提供理论依据，以减少对自然资源的直接利用，并为药用蕨类植物资源的野生保护和合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

分离内生真菌所用的植物材料为凤尾蕨海金沙植株的根、茎和叶，采自江西省九江市南湖公园。分离培养基为WA-抗生素培养基：琼脂20 g、氨苄青霉素200 mg、链霉素200 mg、去离子水1 000 mL；纯化培养基为改良的马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、10% 海金沙叶水浸提液100 mL加去离子水定容至

1 000 mL，自然pH（使用前在培养基中加80 U/mL庆大霉素1 mL）；促孢培养基：KH2PO4 1.0 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、琼脂20.0 g、去离子水1 000 mL，自然pH。

1.2 海金沙内生真菌的分离鉴定

1.2.1 内生真菌的分离培养 取新鲜的海金沙根、茎和叶，用自来水反复冲洗干净，在超净工作台上切成1 cm长的小段，然后进行表面消毒，具体操作流程是：无菌水→0.01%升汞（5 s）→无菌水→无菌水→70%乙醇（5 s）→无菌水→无菌水→无菌水，然后用无菌解剖刀剥取各器官的韧皮部，切成0.5 cm×0.5 cm大小的小片段。用无菌镊子将已经消毒的植物体放在PDA平板上（平板在使用前要加庆大霉素，用量同前，并均匀推平），然后置于25 ℃恒温培养箱中培养，3～5 d后即可看见从植物体周围长出的菌丝。为了检查表面消毒是否彻底，另外做对照处理；将上述同样条件下处理过的材料不作切割直接种植于PDA平板上，置于相同的条件下培养，以样品周围是否有菌丝生长来判断分离菌是否能确定为内生真菌。

1.2.2 内生真菌的分离与纯化 观察从植物体上长出的菌落，挑取不同的菌落在新的平板上培养，反复多次直至得到纯种菌落，然后转入PDA斜面培养基上（试管），再在28 ℃条件下纯化培养，4 ℃冰箱里保藏备用。

1.2.3 内生真菌的鉴定 观察纯化好的单菌落真菌，记录其编号及来源并拍照。从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成装片，置于光学显微镜下观察真菌特征（菌丝、有性或无性孢子、孢子的着生状态等形态特征）。查阅有关真菌分类文献资料[14-16]，确认所分离获得的内生真菌的分类地位。

2 结果与分析

2.1 海金沙内生真菌种群多样性

从海金沙的根、茎、叶组织中共分离获得内生真菌17株，鉴定出16株，另外1株因不产孢而未被鉴定出，分别属于3个纲4个目5个科8个属。在鉴定的8属内生真菌中，以青霉属（Penicillium Link，Fr.）为优势属，占总株数的23.5%，其次是顶枝孢属（Acremonium Link）和链格孢属（Alternaria Nees ex Fr.），各占总株数的17.6%。这些真菌多数属于半知菌纲，少数属于子囊菌纲和核菌纲，表明海金沙内生真菌的分布存在生态分布的种群多样性，具体见表1。

2.2 不同季节对海金沙内生真菌分布的影响

由于季节更替，造成外在环境因素与海金沙体内微生态环境发生变化，使得植物的内生真菌生长条件也随之发生改变，因而导致培养出来的菌株出现一定的差异。具体情况见表2。从表2可以看出，春夏季节培养出来的菌株数量要比秋冬季节的多。由于九江地区夏季比较潮湿，而海金沙正是在潮湿的环境下生长发育比较好，并且这种潮湿环境比较适合内生真菌的生长，其中主要是以青霉属、枝孢霉属为优势属；而秋冬季的湿度与温度都比春夏季低，对内生真菌的生长有所抑制，所以相比较春夏季节真菌的数量较少，但其中的优势属仍是青霉属，另一个优势属是顶枝孢属。这个结果说明海金沙内生真菌的分布存在季节差异，其内生真菌的生态分布与季节有关。

2.3 不同植物器官对海金沙内生真菌分布的影响

海金沙的根、茎、叶等不同器官上发生的内生真菌在种群分布和优势种群以及各种属出现频率的差异比较结果见表3。从表3可见，海金沙不同器官分离出的内生真菌频率高低顺序为茎、根、叶，表明植株各器官韧皮部所占比例大的部位内生真菌数量较多，而木质部所占比例大的部位次之，从叶脉里分离获得的内生真菌数量最少，说明内生真菌在海金沙不同器官上的分布是不同的。

3 讨论

海金沙根、茎、叶等不同器官上的内生真菌在数量、种群分布和优势种群方面都存在较大的差异，说明海金沙内生真菌存在数量和种群多样性的特点。同种植物不同部位内生真菌种类产生差异的原因可能是由于不同部位的微环境如通气状况、酶构成和其他化学成分存在差异造成的，因而适合不同内生真菌类群的侵入和定殖。

从植物中寻找抗菌、抗肿瘤的天然活性物质是长期以来新型药物研究的重要内容和可行途径，现在人类已成功地从红豆杉属（Taxus L.）植物中分离出了内生真菌，并将之开发为生产抗癌新药的生物来源[17]；目前已报道的植物内生真菌的次生代谢产物涉及到抗菌、杀虫、促进植物生长等多个方面[18]。在海金沙植物内生真菌中，某些属种真菌具有潜在的应用价值，如自然界的广布类群青霉属等。而关于海金沙其他内生真菌的潜在应用价值，还有待进一步研究。

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