香椿嫩芽水提取液体外抑菌试验研究

材料

1.1 香椿嫩芽 2015年4月上旬采自恩施本地，新鲜备用。

1.2 菌株 大肠埃希菌（CMCC44102）、产气肠杆菌（CMCC45103）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、表皮葡萄球菌（CMCC12228）为湖北民族学院医学院微生物实验室保存菌种；白假丝酵母菌、铜绿假单胞菌为临床分离菌株，由湖北民族学院附属医院检验科提供。

1.3 培养基 MH琼脂（批号：20150309）、营养琼脂（批号：20150308）由杭州微生物试剂有限公司提供。

1.4 仪器 YXQ-30SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业股份有限公司）；AC2-4S1生物安全柜（ESCO公司生产）；XMT-9017恒温恒湿培养箱（重庆永恒试验仪器厂）；微量加样枪（德国BRAND公司）。

2 方法

2.1 香椿嫩芽水提取液的制备 将50g新鲜的香椿嫩芽连叶带茎杆切碎后加入100ml蒸馏水中，煮沸10min，过滤，浓缩至50ml（即每毫升药液含1g生药）。

2.2 菌种的准备 各种待测菌接种于普通琼脂平板37℃孵育18h（白假丝酵母菌孵育24h）后，挑取适量菌落置于5ml生理盐水中，使其浓度为0.5麦氏标准，再将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍，15min内，将上述被检菌株悬液接种到MH琼脂平板上。

2.3 牛津小杯法[3] 在直径90mm的MH琼脂平板表面滴加菌液0.1ml，均匀涂布。用镊子以无菌操作技术将灭菌后的牛津小杯轻轻放到上述已经涂布了细菌的MH琼脂平板上，每个平板上均匀的放置四个牛津小杯。用微量加样器吸取1g/ml香椿嫩芽水提取液，缓缓加入到牛津小杯中至满（勿外溢），每杯200μl，每个平板上的三个牛津小杯中均加入相同剂量的香椿嫩芽水提取液，剩下的一个牛津小杯中加入200μl生理盐水做空白对照，做好标记，将上述平板平放于37℃恒温培养箱培养16～18h（白假丝酵母菌培养48h）后观察结果。观察小杯周围有无抑菌圈，并测量其大小。每种细菌做3个重复，以抑菌圈直径的平均值为试验结果。

2.4 琼脂稀释法[4]

2.4.1 含药琼脂的制备 将香椿嫩芽水提液原液进行一系列倍比稀释，分别取2ml加入到直径为90mm的平板内，再取融化后已在50℃水浴中平衡0.5h以上的MH琼脂18ml加进平板内（药物：琼脂=1：9），边加边摇晃平板，使药物和培养基充分混匀。

2.4.2 接种 用微量加样器取2μl菌液接种到平板的划定区域，使接种后所形成的菌液圈直径约5～8mm。接种时先接种含药浓度低的平板，再接种含药浓度高的平板，最后接种不含药物的生长对照平板，以检查整个试验过程中测试菌的存活状态。

2.4.3 培养 接种点菌液干后移动平板，置37℃培养16～20h（白假丝酵母菌培养48h）。

2.4.4 结果判断 以不出现菌落的MH琼脂平板上的最低药物浓度为该药对检测菌的最低抑菌浓度（MIC），单一菌落生长可忽略不计。

3 结果

3.1 牛津小杯法的试验结果 见表1。

3.2 琼脂稀释法的试验结果 见表2。

由表1、2可知，新鲜香椿嫩芽水提取液对常见细菌及真菌的生长均有一定的抑制作用，显示有一定的广谱抑菌活性。对革兰阴性细菌大肠埃希菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌抑菌圈直径分别是11.2、11.3、11.4mm，最低抑菌浓度都为12.5mg/ml，对革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑菌圈直径分别是14.2、14.0，最低抑菌浓度为6.25mg/ml，对常见酵母样真菌白假丝酵母菌的抑菌圈直径是14.2mm，最低抑菌浓度为6.25mg/ml。

4 讨论

随着抗生素的广泛应用以及不合理使用，细菌的耐药性现象逐渐增多，为临床治疗疾病带来了很大困难。如何有效防治细菌感染及控制细菌耐药性的产生与播散是一项长期、复杂、艰巨的任务，因而寻找和研制有效的抗菌药物非常必要[5]。中药历史悠久，功效显著，许多研究资料表明，中药在体内外有不同程度的抑菌作用，并且较抗生素不易产生耐药性。另外中药具有毒副作用小，取材方便，经济实惠的优点，因此研究和开发中药抗菌药具有重大意义[6]。

我国香椿树资源丰富，现在一般新鲜的香椿嫩芽只是作为时令蔬菜在食用，它的药用价值，特别是作为抗菌药物使用的价值还没有得到很好的发挥。从研究结果可以看出，香椿嫩芽水提取液具有一定的广谱抑菌活性，在体外对革兰阳性和阴性细菌以及白假丝酵母菌均有抑菌作用，特别是对临床分离菌株铜绿假单胞菌的抑菌作用更有重要意义。因为铜绿假单胞菌具有多重耐药的特性，能天然抵抗多种抗菌药物，Kolar报导铜绿假单胞菌多重耐药株占其临床分离株的4.0%～26.3%[7]。本研究结果将为从香椿嫩芽中提取有效的抗菌成分提供了依据，对合理开发和利用香椿嫩芽资源具有一定的指导意义。

参考文献

[1] 战旗，赵慧英，张毅平.香椿叶黄酮含量的季节性变化[J].中药材，2001，24（1）：14.

[2] 陈丛瑾，王琪，林翠梧.香椿叶的药理作用研究进展[J]中国药房，2011，，22（3）：278.

[3] 唐由凯，刘作春，袁杰.医学微生物学试验教程[M].北京：中国科学技术出版社，2007：85-86.

[4] 管远志，王艾琳，李坚.医学微生物学实验技术[M].北京：化学工业出版社，2005：117.

[5] 钟有添，王小丽，马廉兰.枫香树叶抗菌活性研究[J].时珍国医国药，2007，18（7）：1693.

[6] 马建凤，刘华钢，朱丹.中药体外抑菌研究的方法学进展[J].药物评价研究，2010，33（1）：42.

[7] 倪语星，尚红.临床微生物学与检验（第四版）[M].北京：人民卫生出版社，2007：155.

（收稿日期：2015.12.11）

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