国内单克隆抗体在口蹄疫检测中的应用

摘要：口蹄疫是一种严重危害畜牧业发展，影响世界政治经济被称为“政治经济病”的重大动物传传染病，快速有效的诊断对其防控具有重要的意义，单克隆抗体具有与抗原高特异性结合、理化性状高度均一、可通过细胞培养大量获取等特性，使其在医学领域广泛应用。目前国内外有很多学者将单克隆抗体技术运用于口蹄疫研究中，为口蹄疫的研究开创了新的邻域。本文简要概述一下目前国内单克隆抗体在口蹄疫检测方面的应用。

关键词：口蹄疫；口蹄疫病毒 ；单克隆抗体；口蹄疫检测

中图分类号：S858 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）07-0049-02

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是国际兽疫局规定的A类动物传染病，并被列为18种A类传染病之首，世界卫生组织（OIE）列为通报疾病（List disease），我国列为1类动物传染病。它传播途径多、速度快，是传染病中危害最大的能造成跨国界爆发流行的恶性传染病之一，严重威胁畜牧业的发展、畜产品的进出口贸易、影响人民群众的生产生活及社会经济、政治的稳定发展，故又被称为“政治经济病”。FMD发现至今已有上百年的历史，迄今尚未在全球范围内得到控制和根除。口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）共有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亚洲1型）7种血清型，且极易发生突变，现已知80 多个亚型，目前我国流行的口蹄疫主要为O、A两个血清型[1]。由于该病毒各型之间无交叉保护反应，且同型内的不同亚型的抗原性也存在差别，使得口蹄疫的诊断和控制存在很大的难度。获得一种快速准确地鉴别FMD各种血清型的检测试剂可有效提高FMD的诊断效率，为FMD的控制提供有力依据。

自1975年英国剑桥大学Kohler 和 Milstein两位研究者建立杂交瘤单克隆抗体（单抗）技术以来，1982 年英国普布里斯动物病毒研究所K.c.McCullough等人首次研究出抗口蹄疫病毒O型单抗细胞株，1985 年中国农科院兰州兽医研究所首次在国内建立了分泌O型口蹄疫病毒单抗杂交瘤细胞株，1987年建立了口蹄疫A型单抗细胞株，之后新疆兽医研究所伊米提等、东北农业大学孙静等也先后制备出口蹄疫A型单抗细胞株。随后各种抗FMD单克隆抗体细胞株的获得不仅为动物检疫部门提供了一种快速、方便、灵敏的检疫方法，也为流行病学调查、新疫苗研制和基础理论研究开辟了一条新的途径 。鉴于单克隆抗体具有与抗原高特异性结合、理化性状高度均一、可通过细胞培养大量获得等特性，以下我们就单克隆抗体在FMD检测中的应用做一简要概述。

1 抗原的选择

FMDV 属小 RNA 病毒科（Picornavidae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）。该病毒由VP1、VP2、VP3 和 VP4 4 种结构蛋白及前导蛋白酶（Lpro）、2A、2B、2C、3A、3B、3C 蛋白酶（3Cpro）及 3D 聚合酶（3Dpol）和它们的前体等非结构蛋白构成。口蹄疫病毒的结构蛋白构成其衣壳，不同血清型FMDV 结构蛋白之间存在抗原差异性。而其非结构蛋白主要参与病毒RNA 的复制、裂解以及結构蛋白的折叠、装配等过程，不存在血清型之间的差异。

由于FMDV的7个血清型之间存在共有表位，造成部分单克隆抗体用于检测时在各型间出现交叉反应，因此特异性抗原的选用可提高制备的单抗在FMDV定型检测时的特异性。FMDV全病毒粒子 146S具有较强的免疫原性，而结构蛋白VP1 蛋白是FMDV最重要的抗原位点，也是抗原变异的关键， 是唯一耐受水解蛋白酶的病毒蛋白， 也是在动物体内诱导产生中和抗体的主要成分， 因其高度保守的G-H 环和 C 端在病毒抗原性和免疫原性方面具有重要作用，型特异性最好，所以很多學者致力于VP1蛋白的表达纯化并以此作为抗原来制备单克隆抗体。

2 单克隆抗体在口蹄疫检测中的应用

2.1 抗原的检测

由于口蹄疫存在7个血清型，因此快速定型是该病毒临床诊断中的重点，在FMDV抗原检测时所用的补体结合法、中和试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验、双抗夹心ELISA、胶体金定型试纸条等传统的血清学方法，普遍存在检测周期长，检测方法特异性相对较低等缺点，而实验室常用的敏感性较高的RT-PCR 方法，又易出现交叉污染，不能很好地区分FMDV 的血清型。因此，越来越多的学者着眼于建立一种利用FMDV单克隆抗体的检测方法。周国辉等[2] 以牛抗 FMDV IgG为捕获抗体，制备的AsiaⅠ型单抗ⅠB4为检测抗体，建立了AsiaⅠ型 FMDV 的抗原捕获 ELISA检测方法，该方法可检出0.5859 μg 纯化的 AsiaⅠ型 FMDV 和2.5×103TCID50病毒。李任峰等[3]用O型完整病毒制备的多抗和单抗2G12，分别作为捕获抗体和检测抗体建立的双抗夹心ELISA，可检测出含量90 ng 的病毒。杨沁[4]等以C型FMDV重组 VP1蛋白为抗原，制备单克隆抗体与O、A sial、A型FMDV 以及猪水疱病病毒无交叉反应，为C型FMD的诊断及预防提供基础材料。孙静[5]等用纯化的A型FMDV为抗原制备了单克隆抗体，并以此建立了抗原捕获ELISA方法，该方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用且有效的技术手段。石正旺[6]等以O型FMDV为抗原制备单克隆抗体并建立快速特异性检测方法，可有效区分猪水疱病病毒、A 型和 Asia-I 型 FMDV，敏感性结果与RT-PCR检测结果相符，在批内和批间均具有较好的重复性。林彤[7]等结合羊抗鼠IgG和用柠檬酸三钠还原法标记的抗AsiaⅠ型单克隆抗体，研制出检测AsiaⅠ型FMDV的胶体金免疫层析试纸条，在保证操作简便、快速、灵敏的基础上，满足了实验人员外出采样时所遇到的保存、运输、结果可靠性的问题。张怀宇[8]等用制备的4株抗 AsiaⅠ型FMDV 的单抗建立了ELISA方法，用于检测成品疫苗的FMDV乳化前灭活抗原中的总抗原含量，从而改进不同组织培养方法带来的影响，从而保证疫苗的免疫效率。

2.2 抗體的检测

口蹄疫是一个全球性动物疾病，对于该病的控制与消灭，西方发达国家采用捕杀的方式进行应对，以达到“无口蹄疫区”的效果，而对于发展中国家和落后国家来讲该方法极为不适，大范围的注射疫苗可以有效的控制疫情的暴发，但要想使疫苗发挥更好的作用，就需要准确地区分出疫苗免疫动物和自然感染动物。目前，结果可信度较高的区分自然感染动物和疫苗免疫动物的方法是检测动物体内抗非结构蛋白3B和多聚蛋白 3ABC的抗体。国内尚无利用单克隆抗体制备检测试剂来区分口蹄疫自然感染动物和疫苗免疫动物的。

我国目前内任采用大范围注射常规灭活疫苗免疫来控制FMD的流行。且采用国际上最常用的病毒中和试验和液相阻断ELISA方法[9]来检测免疫动物的抗体水平。鉴于传统检测方法检测周期长，实验室采用的分子生物学方法受条件制约不利于基层推广，而ELISA 检测法操作简单、快捷、重复性好、灵敏度高，便于大范围推广和用于批量检测，因此，许多学者致力于FMD的ELISA 检测方法的研制。向敏等[9] 利用AsiaⅠ口蹄疫病毒vp2蛋白制备单克隆抗体，并建立了单抗竞争ELISA方法，检测AsiaⅠ型口蹄疫抗体，临床应用表明，该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒及荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达89.0%与86.5%。林彤[10]等分别用纯化的AsiaⅠ型VP1蛋白和标记的抗AsiaⅠ型FMDV的单克隆抗体作为抗原和抗体，建立单克隆抗体竞争ELISA用于AsiaⅠ型猪FMDV抗体的监测。利用特异性和敏感性较高的单克隆抗体建立的竞争 ELISA，不仅可以避免利用多抗检测时出现的非特异性的影响，还可通过酶标的方法检测多宿主动物样品，从而达到更高的抗体监测水平。

3 结语

作为“政治经济病”的动物传染病，口蹄疫防控与治理依然受到世界各地的关注。现阶段我国口蹄疫的流行以O型和A型为主。虽然目前使用的ELISA方法可区分 FMDV 的 7 种血清型抗原及猪水泡病病毒（SVDV），但由于O型和A型的抗原性很广，很难区分疫苗株与田间分离株，制备出特性的检测试剂，有效区分自然感染动物和注苗动物的极为紧迫。目前，国内致力于口蹄疫单克隆抗体研究的学者很多，而利用单克隆抗体制备出有效检测试剂的很少，选取优势、特异且广谱的抗原表位获取抗原，制备高特异性的单克隆抗体，使FMDV的单克隆抗体在易感动物的被動免疫中发挥出其潜在的应用价值，提高检测结果的精确度，使单克隆抗体技术在口蹄疫防治工作更加完美的实现其价值。

参考文献

[1]何继军，郭建宏，刘湘涛.我国口蹄疫流行现状与控制策略 [J].中国动物检疫， 2015，32（6）：10-14.

[2]周国辉，李万，赵磊，等.抗AsiaⅠ型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获EUSA检测口蹄疫病毒的研究[J].中国预防兽医学报，2007，29（12）：960-964.

[3]李任峰，何启盖，刘正飞，等.口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用[J]. 生物技术通报， 2006，增刊：544-548.

[4]杨沁，林彤，常惠芸，等. C型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 甘肃农业大学学报，2013，1（48） ：1-5.

[5]孙静，周国辉，王幸等. 抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获 ELI SA 检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报， 2013，35（2）：146-150.

[6]石正旺等.O型FMD固相竞争ELISA及双抗夹心ELISA方法的建立与应用.甘肃农业大学， 2016 届硕士学位论文， 2016 ：18-38.

[7]林彤，邵军军，丛国正，等.AsiaⅠ型口蹄疫病毒胶体金免疫层析检测方法的建立[J].生物工程学报， 2009，25（5）：767-772.

[8]张怀宇，王泰健，赵耘，等. 抗AsiaⅠ型口蹄疫单克隆抗体的制备及初步应用[C].中国畜牧兽医学会 2006 学术年会， 2006：772-776.

[9]向敏，张克山，卢顺，等.AsiaⅠ口蹄疫VP2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立[J]. 生物工程学报， 2008，24（9）：1664-1669.

[10]林彤， 邵军军， 丛国正， 等. 利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA 方法[J]. 安徽农业科学，2009，37（23）：11025-11026.

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