蚂蟥冬眠临界温度的研究

[摘要] 采用生物学观测法、静水法、3，5二硝基水杨酸比色法、对棕榈酸硝基苯酯（ρNPP）比色法、福林酚法观测和测定不同温度下蚂蟥生物学特征、耗氧量、耗氧率、消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性。结果表明，随着温度的降低，蚂蟥活动减弱、进食减少，4 ℃后不食不动，头部和尾部弯曲呈“弯月”状；耗氧量、耗氧率以及消化道酶活性随温度下降逐渐下降，10 ℃后下降趋势减缓，4 ℃后趋于稳定，不随温度降低而变化；在4 ℃状态40 d 过程中，淀粉酶变化不显著，脂肪酶、蛋白酶活性在20 d 时有所降低，其中脂肪酶下降后又轻微上升后保持较低水平。结论，4 ℃为蚂蟥冬眠的临界温度，“弯月”状可作为其冬眠状态的标志。

[关键词] 蚂蟥； 冬眠临界温度； 生物学特性； 耗氧量； 耗氧率； 消化酶

蚂蟥Whitmania pigra Whitman又称宽体金线蛭，是2015年版《中国药典》药材水蛭的主要基原动物，具有破血通经，逐瘀消癥的作用[1]，是众多心脑血管中成药的主要原料。蚂蟥是变温动物，当外界环境温度降到一定程度后，蚂蟥会通过逐渐减少自身活动、进食、乃至冬眠，尽可能地降低自身新陈代谢和能量消耗，以利度过寒冷和冬季。虽然近年来蚂蟥人工养殖已取得初步成功，但“冬眠”这一固有生物习性极大程度影响了蚂蟥养殖的规模和效率。目前，对蚂蟥的研究主要集中在呼吸和消化生理、摄食规律及分子生物学等方面[27]，有关蚂蟥冬眠临界温度的研究尚未见诸报道。本研究拟通过研究温度对蚂蟥行为生物学、呼吸生理和消化生理3方面的影响探究蚂蟥冬眠的临界温度，为蚂蟥室内人工养殖和越冬管理提供科学依据。

1 材料

蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Wh. pigra。

MR200溶氧测量仪（南京特安科贸有限公司）、FYLYS108L低温保存箱（北京福意电器有限公司），呼吸仪（自制），XHFD内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），5810R离心机（Eppendorf公司），Alpha1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司），FA 1104分析天平（上海精科天平），ZD2型自动电位滴定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

2 方法

2.1 耗氧量、耗氧率的试验设计 试验用蚂蟥暂养7 d，试验前停食2 d，每组随机选取3条10 g左右体格健壮的蚂蟥（重复10次），置于480 mL注水2/3体积的广口玻璃瓶中。试验初始温度为25 ℃，以1 ℃·d-1的速率降温，分别于25，20，15，10，8，6，4，2 ℃稳定1 d后观察记录蚂蟥在各温度下的活动状态，同时进行耗氧量、耗氧率的测定。

2.2 消化酶活力的试验设计 在2.1结果的基础上设计试验，蚂蟥前期处理同2.1。试验初始温度为25 ℃，先以2 ℃· h-1的速率将水温调节至10 ℃，再以1 ℃·d-1的速率降温至4 ℃，分别于10，8，6，4，2 ℃稳定1 d后取样测定。

以上述试验结果为基础，分别于4 ℃稳定10，20，30，40 d后取样测定，以4 ℃稳定1 d 为对照。

2.3 耗氧率的测定方法 参照杭德荣等[8]采用静水法测定，稍加改进，测定总时间为4 h。在水流入呼吸室的过程中，使用溶氧仪在进水口处测定水中的溶氧量标记为DOt1（mg·L-1）；当水充满后密闭呼吸室，准确计时4 h后，测定出水中溶氧量标记为DOt2（mg·L-1）。

2.4 消化酶的测定方法 酶液的制备：每组选取3条健壮蚂蟥（3次重复），固定于冰盘内解剖，取出整个消化道，剔除附着物，用预冷的蒸馏水洗净，吸干组织表面水分，称重，冰浴中进行匀浆，同时加蒸馏水，稀释成含原浆20%的溶液，4 ℃离心15 min（转速为8 000 r·min-1），所得上清液为酶液，置于4 ℃冰箱中低温保存，并于24 h内完成测定。

淀粉酶活力采用3，5二硝基水杨酸比色法[9]测定，在37 ℃条件下，单位体积的酶量1 min水解淀粉生成1 mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位；脂肪酶活力参照史红专等采用对棕榈酸硝基苯酯（ρNPP）比色法[10]测定，在37 ℃条件下，1 min催化释放1 μmol对硝基酚的酶量定义为1个酶活力单位；蛋白酶活力采用福林酚法[9]测定，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。组织匀浆液蛋白含量采用考马斯亮蓝G250比色法[9]测定。

2.5 数据分析 试验所得数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 20.0软件包（OneWay ANOVE，LSD）进行分析，P<0.05为差异显著。

3 结果与分析

3.1 不同温度下蚂蟥的活动状态 25 ℃时，蚂蟥活动极为活跃，尾部吸盘吸附于容器壁或者全体在水中“波浪式”游动；与25 ℃相比，20，15 ℃时蚂蟥活跃程度都有所下降，15 ℃时可见部分蚂蟥尾部吸盘吸附于容器壁呈“悬挂”静止状态，游动较少；10 ℃时，蚂蟥身体收缩逐渐静止于容器底部，无游动现象；4 ℃后，蚂蟥头部和尾部弯曲，呈现“弯月”状，不食不动伏于瓶底。整个实验过程无蚂蟥死亡。

3.2 不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响 不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响结果见图1。随着温度的降低，蚂蟥的耗氧量、耗氧率逐渐下降。降温至4 ℃前，除6 ℃与8 ℃组无显著差异外，各温度组之间均有显著性差异（P<0.05），其中10 ℃前耗氧量、耗氧率降低趋势最明显，10 ℃后降低趋势逐渐减缓，4 ℃和2 ℃已无变化。

3.3 不同温度对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响 不同温度对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响结果见图2～4。随着温度的逐渐降低，蚂蟥消化道酶活性均呈不同程度降低趋势，与25 ℃相比各温度组消化酶活性均显著降低（P<0.05）；10 ℃后，各酶活性降低趋势渐缓，

3.4 4 ℃不同处理时间对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响 蚂蟥在4 ℃状态下，不同处理时间对各消化道酶活性的影响见图5～7。可以看出淀粉酶在整个过程中变化不显著，脂肪酶和蛋白酶活性在20 d时又有所降低，然后保持在较低水平，之后各阶段均未有显著差异。

4 讨论

4.1 温度对蚂蟥行为生物学的影响 休眠是动物对恶劣环境的一种生理适应[11]，是动物为了适应自然界环境的变化（尤其温度的变化），维持个体生存的一种独特生理过程。在休眠状态下，变温动物体温降低到与环境只相差1～2 ℃，呼吸和心率极度减慢，代谢降到最低限度。研究表明，变温动物在进入冬眠的过程中，行为生物学会发生很大变化。邓利等[12]发现随温度的下降，巴塘攀蜥Japalura batangensis取食量、日活动量逐渐降低，进入冬眠后，取适量、日活动量变为零。佟庆等[13]研究表明，东北林蛙Rana dybowskii在群居冬眠时，四肢蜷曲、头部朝下、一直处于不食不动的状态。本试验观察到，随温度的降低，蚂蟥活动减弱、进食减少，逐渐由伸展的“悬挂”状态变为收缩“静止”状态，4 ℃后不食不动，同时可以观察到由于头部和尾部弯曲呈现“弯月”状，这种伏于底部不食不动的现象在刺参Apostichopus japonicus、无蹼壁虎Gekko swinhonis[1415]休眠的研究中也都有类似报道。因此，从温度对蚂蟥行为生物学影响的结果来看，本研究认为4 ℃可能是蚂蟥冬眠的临界温度，而蚂蟥呈现的“弯月”状则可能是其冬眠状态的特异性标志。

4.2 温度对蚂蟥呼吸代谢的影响 耗氧率的高低表明动物新陈代谢的快慢，是衡量动物呼吸代谢的关键指标，王丽文等[16]以耗氧量为指标，发现爪鲵Onychodactylus ficheri Boulenger的代谢率与环境温度呈正相关，本研究结果与上述结果一致，表明蚂蟥的代谢率与环境温度呈正相关。

研究表明当温度降低至一定程度时，变温动物通常会因为对低温的适应处以较低代谢的水平或逐渐进入冬眠状态。本研究显示，随着温度的进一步降低，蚂蟥逐渐停止活动，4 ℃时耗氧量、耗氧率极低不再随温度下降，逐渐趋于稳定，与紫色食草蟹Hemigrapsus oregonensis[17]耗氧率至5 ℃、钉螺Oncomelania hupensis hupensis[18]耗氧量至3 ℃以下时不再继续降低而逐渐趋向平稳的研究结果相类似。

研究表明变温动物耗氧量与冬眠存在一定的相关性，洪青标等研究发现钉螺[19]耗氧量与冬眠率间存在非常显著的直线回归关系（R2=0.916，F=75.88，P<0.01），当冬眠率达到100%时，氧代谢也将维持在一定水平。本研究结果也显示，当温度降低至4 ℃后，蚂蟥的耗氧量基本不再变化，与蚂蟥的生物学体征相符合，进一步可以认为4 ℃为蚂蟥的冬眠临界温度。

4.3 温度对蚂蟥消化生理的影响 环境温度不仅影响动物的呼吸代谢，还能够直接影响动物的摄食量和消化酶活性，并显著影响动物肠道运输时间和营养物质消化[2021]。Gao等[22]研究了不同温度下刺参消化道内各消化酶活性，发现随着温度的上升，各消化酶活性大体上呈现先上升后下降的趋势，并通过消化酶的变化分析得出，28 ℃下刺参会进入夏眠状态的结论。BalslevClausen等[23]发现松鼠Spermophilus tridecemlineatus冬眠6周后胰淀粉酶活性降低到夏天活跃期的50%左右。本实验研究表明，随着温度的降低，蚂蟥各消化道酶均呈现下降的趋势，10 ℃时，各消化道酶活性均显著低于25 ℃水平，4 ℃后，维持一个较低水平不再变化，表明4 ℃后蚂蟥基本没有进食的可能，这可能是蚂蟥为适应低温环境而采取的营养代谢策略。

此外，本实验结果还显示，随着蚂蟥在4 ℃状态下天数的增加，蚂蟥消化道淀粉酶活性在整个过程中变化并不显著，而脂肪酶和蛋白酶活性却在20 d 时略有降低，其中脂肪酶活性下降后又轻微上升，由于消化酶活性的大小反应了动物机体的消化能力[4]，因此推测可能随着进入冬眠时间的延长，蚂蟥不得不消耗自身脂肪来补充身体能量的需要，具体机理有待于进一步研究。

综上所述，由于蚂蟥在4 ℃状态下呼吸代谢和消化代谢非常微弱，只能维持生命特征的最低要求，结合蚂蟥在不同温度下的生物学特征，本研究认为4 ℃为蚂蟥的冬眠临界温度。

蚂蟥冬眠临界温度的确定不仅为蚂蟥冬眠机制的研究奠定基础，同时可为蚂蟥入冬和工厂化养殖提供科学指导。本实验仅探索了蚂蟥的冬眠温度，至于蚂蟥可耐受的极限低温及出眠方式仍有待今后进一步研究。

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[责任编辑 吕冬梅]

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