花粉管通道法介导的铁皮石斛转基因技术

摘要： 该研究以含有GFP和GUS基因的质粒和农杆菌为载体，采用花粉管通道法对铁皮石斛进行转基因技术研究。结果表明：（1）铁皮石斛种子萌发和原球茎生长对卡那霉素的最低致死浓度分别为90和150 mg·L1。进一步研究证实，在筛选转化种子和原球茎时，可分别向培养基中添加100和150 mg·L1的卡那霉素进行选择培养。（2）以携带GFP和GUS基因的质粒（pSuper1300和pBI121）和农杆菌为载体，用无菌去离子水重悬质粒pSuper1300和pBI121至浓度为100 ng·μL1，用2%蔗糖+1/2MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5%蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS重悬携带质粒pSuper1300和pBI121的农杆菌至菌液浓度为OD600=0.7～0.8；在授粉后0.5～2.5 h内使用柱头滴加法导入携带外源基因的质粒或农杆菌溶液，收集成熟的转化种子，经选择培养及PCR检测发现，几乎所有处理的转化材料均能检测出外源GFP和GUS基因片段。另外，与农杆菌相比，以质粒为载体进行转化，可获得更高的结实率。该研究结果为铁皮石斛的基因工程育种提供了参考。

关键词： 铁皮石斛， 花粉管通道法， 质粒， 农杆菌， 转基因

中图分类号： Q943.2， Q785文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09110110

Abstract： The transgenic technology of Dendrobium officinale was studied by using pollentube pathway with plasmid and agrobacterium vectors as target genes delivery. The main results were summarized as follows： （1） The minimum lethal concentration of kanamycin to seed germination and protocorm growth were 90 and 150 mg·L1 respectively. Further study showed that 100 and 150 mg·L1 kanamycin could be added for selecting transgenic seeds and protocorms during selective culture in vitro respectively. （2） Plasmid and agrobacterium contained GFP or GUS gene was transferred into D. officinale via pollentube pathway. The technology and method were summarized as follows： Collected target plasmid （pSuper1300 and pBI121） and agrobacterium which contained GFP or GUS gene； resuspended the plasmid pSuper1300 and pBI121 to concentration of 100 ng·μL1 with thrice distilled water， while resuspended the agrobacteria which carried plasmid pSuper1300 and pBI121 to OD600=0.7-0.8 with the solution of 2% sucrose+1/2MS+0.1% silwet77+0.1% AS or 5% sucrose+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS respectively； during 0.5-2.5 h after artificial pollination， used stigma dripping method to transfer into plasmids and agrobacteria which contained target genes； collect the mature seeds； selective culture and PCR certificated that the resistant materials of almost all treatments were integrated GFP and GUS genes. Moreover， compared with agrobacterium as target gene delivery， the plasmid gene delivery could harvest more fruits.

Key words： Dendrobium officinale， pollentube pathway， plasmid， agrobacterium， transgene

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物（张启香和方炎明，2005），是《中华人民共和国药典》中收载的5种石斛属植物之一，被称为石斛中的极品（邵华等，2004），有“中华九仙草”之首的美誉，是我国传统的名贵中药材，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗衰老等作用。由于铁皮石斛生长速度缓慢，对生长环境要求又十分苛刻，自然产量极为稀少，加上长期无节制的采集，致使天然的铁皮石斛濒临灭绝。利用生物技术进行人工繁殖和种质改良是解决这一问题的有效途径。目前，铁皮石斛组织培养技术已日趋成熟，但由于铁皮石斛野生资源繁多、品质良莠不齐，加之育种盲目、育种技术研究滞后，导致市场缺乏优良、富有特色的铁皮石斛新品种，铁皮石斛产业发展缓慢（郑希龙等，2011）。为了适应铁皮石斛规模化栽培的生产需要，保障鐵皮石斛产业的持续发展，开展加强铁皮石斛抗病抗逆能力及药用成分含量高的优良品种的育种研究工作，迫在眉睫。常用的铁皮石斛育种方法有杂交育种、诱变育种、倍性育种及基因工程育种。其中，基因工程育种以其目的明确而受到青睐。

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