ＲＧＤ多肽表面修饰对ＨＡ－ＴＣＰ生物陶瓷修复骨缺损的影响

[摘要]目的：了解精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp，RGD)多肽表面修饰对羟基磷灰石－磷酸三钙(hydroxyapatine－tricalcium phosphate，HA－TCP)修复节段性骨缺损的影响。方法：以骨髓基质干细胞(marrow stromal cells，Mscs)复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP或单纯材料培养制备组织工程骨，选择60只新西兰白兔，制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型，实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入Mscs复合HA－TcP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA－TCP；D组：骨缺损区植入HA－TCP。术后4、8、16周取材，行X线检查、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定。结果：术后4、8、16周各组骨缺损区均有新骨生成，成骨量随时间的推移而增加。经X线、组织学和生物力学评估，成骨能力依次为：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，其中A组术后16周骨缺损完全修复，骨髓腔再通，生物力学性能接近正常骨。结论：RGD多肽表面修饰对以HA－TCP为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。

[关键词]组织工程；表面修饰；骨髓基质干细胞；修复

[中图分类号]Q813.1　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)06－0723－04

RGD多肽是介导种子细胞与支架材料粘附的多肽链，RGD序列可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面白发形成一分子层，为与受体介导的种子细胞提供特异性位点而促进细胞的粘附和分化。本研究旨在应用RGD多肽对HA－TCP材料进行表面修饰处理，以促进MSCs在其表面的粘附和生长，为骨组织工程提供一种支架材料的表面修饰手段。

1　材料和方法

1．1　材料准备：HA－TCP双相多孔生物陶瓷(四川大学生物材料工程研究中心)含60％HA和40％TCP，孔隙率为50％～70％，孔隙直径为200～500~m。将材料修整为1.5cm×0.5cm×0.5cm大小，蒸馏水加压反复冲洗，去离子水超声清洗2次，每次30min，高压蒸汽灭菌后备用。将RGD多肽(美国Peptide生物工程公司)溶解于50％乙醇中，浓度为2mmol/L。将材料分别置于带胶皮塞的离心管中，加入RGD多肽溶液，负压抽吸使RGD多肽溶液进入材料孔隙内，4℃放置24h，吸除溶液，晾干。用pH值为7.4的0.0lmol/L PBS漂洗至中性，晾干。

1．2　组织工程骨制备：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1 800r/min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×10⁶/ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0.25％胰蛋白酶(sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含1×10^-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C和1×10^-2mol/L β－磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×10⁶/ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养7天。

1．3　动物模型和实验分组：选择3周龄雌性新西兰白兔60只，体重为2.0～2.5kg。动物全身麻醉后，常规消毒双上肢，沿上肢前外侧做纵行切口，长25mm，逐层切开、分离、显露桡骨，于桡骨中上1/3交界处截骨，去除桡骨和骨膜，制造15mm长的右侧肢体桡骨节段性骨缺损模型。实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组，每组实验动物10只，其中A组：骨缺损区植入MSCs复合RGD多肽表面修饰的HA－TCP培养制备的组织工程骨；B组：骨缺损区植入MSCs复合HA－TCP培养制备的组织工程骨；C组：骨缺损区植入RGD多肽表面修饰的HA－TCP；D组：骨缺损区植入HA－TCP。

1．4　检测项目

1．4．1大体观察和x线检查：术后观察动物饮食、活动，伤口有无肿胀、分泌物等。术后4、8及16周X线摄片，根据Lane等(1987)的X线评分标准对各组移植区骨形成、骨连接和骨塑形进行评分。术后4、8及16周处死动物，取尺桡骨全段，观察移植物的颜色、质地和血管形成，与宿主骨融合和周围软组织分布情况。

1．4．2　组织学观察：标本经4％多聚甲醛固定后，乙醇梯度脱水，有机树脂包埋。用硬组织切片机(德国Leica公司)制作厚度为5μm切片标本，行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察移植区的骨愈合情况。用MLAS医用计算机图像分析系统(四川大学计算机学院)采集术后4周和16周的组织切片，在4倍物镜下寻找包含移植材料的视野，计算每一视野中材料与材料内所形成新骨的面积百分比。

1．4．3　生物力学测定：用万能材料试验机(美国Instron公司)测量各实验组术后16周尺桡骨标本的最大扭转强度，以正常兔的尺桡骨为对照。

1．5　统计学方法：采用SPSS 10.0软件包对检查结果行多个样本均数的方差分析和两两比较的口检验，P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2．1　大体观察：各组动物术后上肢均有不同程度肿胀，1周后症状消失。术后4周，A和B组移植材料与宿主骨界线不清，结合牢固，推之不动，有骨痂向材料中央延伸。C和D组移植材料与宿主骨界线清晰，周围有大量纤维组织和血管长入。术后8周，A和B组移植材料与宿主骨牢固融合，材料表面有坚硬外骨痂形成，骨痂开始塑形。C和D组移植材料与宿主骨界线模糊，移植材料与宿主骨交界有大量骨痂形成。术后16周，各组移植材料被骨痂完全包围，移植材料与宿主骨界线消失。术后各时期，移植材料周围软组织未见变性、坏死和囊性变。

2．2　X线检查

2．2．1　X线观察：A和B组术后4周，截骨端有新骨形成，移植材料纹理模糊；8周，大量新骨形成，移植材料边界不清，部分髓腔再通；16周，新生皮质骨与宿主皮质骨自然连接，显示出正常骨干结构，移植材料分辨不清，髓腔再通。C和D组术后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料纹理清晰；8周，大量新生骨向材料中心生长，移植材料边界不清；16周，髓

腔部分再通，骨缺损存留少量移植材料。

2．2．2　X线评分：移植区骨形成、骨连接和骨塑形的X线综合评分，成骨能力依次为：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，结果见表1。

2．3　组织学观察

2．3．1　A组：术后4周，移植材料周围和内部出现大量软骨细胞和成骨细胞，呈岛状生长的新生骨组织贯穿整个移植材料；8周，新生骨小梁周围可见大量成骨细胞和破骨细胞，编织骨向板层骨过渡，移植材料逐渐被新生骨取代，骨髓腔出现；16周，移植材料完全被新生骨取代，骨小梁排列整齐，皮质骨形成，骨髓腔再通。

2．3．2　B组：术后4周，移植材料周围和内部出现有软骨细胞和成骨细胞形成，材料周围形成大量新生骨；8周，骨小梁周围出现大量成骨细胞和破骨细胞，移植材料内部出现交错排列的编织骨，骨髓腔出现；16周，新生骨逐渐改建为板层骨，但不完善，骨缺损大部分被修复，仍存留少量移植材料。

2．3．3　C组：术后4周，移植材料周围有软骨细胞和成骨细胞形成，新生骨桥接移植材料和宿主骨；8周，材料周围出现大量成骨细胞和破骨细胞，新生骨增多并向材料内长入；16周，新生骨逐渐取代移植材料，骨髓腔出现，骨改建尚不完善。

2．3．4　D组：术后4周，移植材料周围有软骨细胞和成骨细胞形成，材料周围形成大量新生骨，新生骨呈明显的梯度生长，靠近界面端成骨细胞活跃，远离界面的部位成骨较少；8周，移植材料周围和内部成骨细胞和破骨细胞聚集，材料内部出现交错排列的编织骨，新生骨逐渐取代移植材料；16周，移植材料被新生骨取代，骨髓腔出现。

2．4　组织形态计量学：移植材料植入体内后，随着时间的推移，新骨形成增多，材料逐渐被降解，采集术后4周和16周的组织切片，寻找包含移植材料的视野，计算移植材料与材料内形成新骨面积百分比，推断各组成骨能力依次为：A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，结果见表2。

2．5　生物力学测定：术后16周尺桡骨力学强度比较，A＞B＞C＞D(P＜0.001，P＜0.05)，A组术后16周尺桡骨力学强度接近正常尺桡骨(P＞O.05)，结果见表3。

3　讨论

种子细胞与支架材料粘附能力的大小与细胞和材料表面的物理和化学性质有关。由两者表面物理性质所决定的粘附作用称为非特异性粘附；如果粘附涉及两者表面分子之间的相互作用，则称为特异性粘附，或称为细胞识别。细胞与材料的粘附不仅取决于细胞的表面性质，而且与细胞内部结构和功能变化密切相关。细胞与材料的非特异性粘附包括静电斥力、范得瓦耳斯力和立体结构稳定性产生的斥力等。细胞与材料的特异性粘附包括钙粘附蛋白、固有粘附蛋白和Ig超家族粘附分子等。细胞与材料表面粘附的位点称为粘附斑(adhensionplaques)，这种接触是一种紧密连接，细胞膜与材料表面的距离在10～15nm。支架材料对细胞的粘附主要通过特异性受体－整合素(integrin)发挥作用，整合素是由a、β两个亚基组成的跨膜受体。已知有14个a亚基和8个β亚基，a、β亚基的外区构成受体与特异性配体的结合，最常见的配体位点是RGD序列。整合素一方面介导细胞与细胞问及细胞与细胞外基质的粘附，另一方面具有传递信号的功能，联系细胞内外的代谢活动，对细胞的生长代谢起重要。成骨细胞可分泌I型胶原、骨钙素、骨结合素、骨桥蛋白、纤维连接蛋白和生长因子等。这些蛋白中均含有RGD序列，它可被细胞膜表面的整合素受体特异性识别，激活细胞内的蛋白酶、蛋白激酶、磷酸酶等信号传导系统，促使细胞发生一系列生理和生化反应，铺展而粘附于材料表面。成骨细胞可表达a1、a2、a3、a4、a5、a6、β1、β3等亚基，a5β1为纤维连接蛋白受体，识别纤维连接蛋白的RGD序列。Shin等证实纤维连接蛋白a5 β1的抗体，以及与纤维连接蛋白竞争a5 β1的短肽RGD可抑制成骨细胞的钙化，说明纤维连接蛋白与受体a5 β1的相互作用是成骨细胞钙化成骨的先决条件。

HA－TCP双相多孔生物陶瓷是骨组织工程应用较为广泛的化学合成支架材料，但多孔块状的HA－TCP存在材料表面的亲水性差、表面自由能低、缺乏细胞识别和吸附位点等缺点，易使接种细胞流失，不利于接种细胞的粘附和生长，直接影响组织或器官的组织工程化研究。通过在材料表面固定氨基酸、多肽、蛋白质、粘附因子来改善材料表面的亲和性，可进一步优化组织工程支架材料的粘附性能。我们的研究表明，RGD多肽表面修饰的HA－TCP材料的细胞相容性明显优于单纯材料，RGD多肽修饰的材料可粘附较多的MSCs在其表面和孔隙内生长、分化和增殖，RGD多肽表面修饰对以HA～TCP为支架材料组织工程骨的修复作用有明显优化作用。Park等的研究发现，赖氨酸－精氨酸－丝氨酸－精氨酸(Lys－Arg－Ser－Arg)可选择性增强硫酸乙酰肝素介导的成骨细胞粘附机制，这种粘附作用不同于整合素介导的细胞粘附机制，具有成骨细胞特异性粘附作用。用这种短肽包埋的基质材料可显著提高成骨细胞的粘附，减少内皮细胞或成纤维细胞的粘附，是一种良好的骨组织工程支架材料包埋剂。对于多种组织组成复杂器官的组织工程再造，细胞的特异性粘附更具有应用价值。在基质材料的不同空间引入不同的细胞粘附序列，引导不同组织细胞在特定位置生长，可望再造多组织复杂器官。

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