人参皂苷20（s）—Rg3对llc—pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用

摘要 目的：探讨人参皂苷20（s）-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用。方法：通过基于细胞的肾脏保护试验，研究了发酵黑参（FBG）及其活性成分人参皂苷20（S）-Rg3对猪肾（LLC-PK1）细胞中顺铂（化疗药物）诱导的损伤的保护作用。结果：由顺铂诱导的细胞活力降低，再使用FBG提取物和人参皂苷20（S）-Rg3依赖剂量后明显恢复。用FBG提取物或人参皂苷20（S）-Rg3处理后会降低顺铂诱导升高与磷酸化c-Jun N-末端激酶（JNK），p53和裂解的半胱天冬酶-3升高的蛋白。通过用FBG和人参皂苷20（S）-Rg3的共同处理，由于顺铂的诱导导致凋亡LLC-PK1细胞升高的百分比显著降低。结论：人参皂苷20（s）-Rg3可改善LLC-PK1的细胞毒性，人参皂苷20（S）-RG3可能是通过阻断JNK-P53-caspase-3信号级联反应来介导这种作用的重要组成部分。

关键词 顺铂；人参皂苷20（S）-Rg3；llc-pk1细胞；c-Jun N-末端激酶；肾毒性；发酵黑参；丝裂原活化蛋白激酶；细胞外调节蛋白激酶；磷酸脱氢酶；甘油醛-3-磷酸脱氢酶

Abstract Objective：To discuss protective effects of ginsenoside 20 （s）-Rg3 on renal toxicity induced by cisplatin in llc-pk cells. Methods：The protective effect of fermented black ginseng （FBG） and its active ingredient ginsenoside 20 （S） -Rg3 on cisplatin induced damage induced by cisplatin （chemotherapeutic drugs） in pig kidney （LLC-PK1） cells was studied by cell based renal protection test.This article studied the protective effect of fermentation of black ginseng cells （FBG） and its active component ginsenoside 20 （S）-Rg3 on porcine kidney （LLC-PK1） cells in cisplatin （chemotherapy）-induced injury based on kidney protection test. Results：The cisplatin induced cell viability decreased， and then FBG was used to extract and ginsenoside 20 （S）-Rg3 was restored by FBG. After the dose dependent or extract ginsenoside 20 （S） after-Rg3 treatment may reduce cisplatin induced increased phosphorylation of c-Jun and N-terminal kinase （JNK）， p53 and caspase cleavage the increase of-3 protein. By using FBG and 20 ginsenosides （S） together with-Rg3， the percentage of cisplatin induced apoptosis in LLC-PK cells leaded to increased significantly. Conclusion：FBG and its major ginsenoside 20（S）-Rg3， ameliorated cisplatin-induced nephrotoxicity in LLC-PK cells by blocking the JNKep-53-ecaspase-3 signaling cascade.

Key Words Cisplatin； Ginsenoside 20 （S）-Rg3； llc-pk cell； c-Jun N-terminal kinase； Nephrotoxicity； FBG； MAPK； ERK； Phosphate dehydrogenase； Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.045

人参是最著名的中草药之一，其个体成分可增强肾功能[1]。人参通过减弱氧化应激有效地改善了大鼠链脲佐菌素诱导的肾功能障碍[2-4]。最近，评价人参引起的药物肾毒性的作用，以及参与这一反应的机制和活性成分，还有人参潜在的肾脏保护功效成为人们感兴趣的研究领域[5-7]。人参可防止大鼠庆大霉素（一种氨基糖苷类抗生素）引起的肾损伤[1]。庆大霉素诱导的肾毒性与氧化损伤有关。与人参共同施用，通过抑制自由基形成和抗氧化系统的恢复来减少庆大霉素诱导的肾损伤。在人参的几个成分中，酚酸、黄酮，负责增加肾血流量和消除自由基，表现出对庆大霉素诱导的氧化毒性的保护作用[8-11]。

目前对开发方法已经进行了研究，可使用热加工来提高人参转换为达玛烷型皂苷的药理功效。按照这个概念，已经准备了黑参作为原料人参来进行热加工和发酵。虽然一些对于人参的研究集中在其对糖尿病的保护作用[3]，但还不清楚黑参对药物诱导的肾毒性的影响。

本研究旨在研究黑参及其活性成分人参皂苷20（S）-Rg3对猪肾（LLC-PK1）细胞中顺铂（化疗药物）诱导的损伤的肾脏保护作用。此外，我们着重评估丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作为黑参在肾脏保护作用中的重要影响。

材料与方法

1. 材料

1.1. 细胞

猪肾（LLC-PK1）细胞（美国，美国典型培养物保藏中心）。

1.1.2 药物

人参皂苷20（S）-Rg3（中国，长春市凯瑞化学试剂经销站）；顺铂（美国，美国Sigma公司）。

1.1.3 试剂与仪器

DMEM培养基（美国，美国Sigma公司）；胎牛血清（美国，Thermo公司）；p38-促分裂素原活化蛋白激酶试剂盒（美国，美国Sigma公司）；Ez-Cytox试剂（美国，美国Sigma公司）；磷酸化-p38试剂盒，p44/42（美国，美国Abcam公司）促分裂素原活化蛋白激酶-细胞外信号调节激酶试剂盒（美国，美国Abcam公司）；放射免疫沉淀测定缓冲液（美国，美国Sigma公司）；磷酸化-p44/42，c-Jun-N-末端激酶试剂盒（JNK）（美国，美国Abcam公司）；化学发光预先蛋白质印迹检测试剂（美国，美国R&D公司）；Tali凋亡试剂盒（美国，美国Invitrogen公司）；磷酸化末端激酶试剂盒（美国，美国Abcam公司）；p53，裂解的半胱天冬酶-3试剂盒（美国，美国Abcam公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶试剂盒（GAPDH）（美国，美国Abcam公司）和辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体试剂盒（美国，美国Abcam公司）。

细胞培养箱（美国，Thermo公司）；酶标仪（美国，Bio-Rad公司）；凝胶成像仪（美国，Bio-Rad公司）；Tali图像的细胞仪（美国，Thermo公司）；Fusion Solo化学发光系统（法国，法国VILBER公司）。

1.2 方法

1.2. 分组与模型制备

人参干粉提取物由北京同仁堂吉林人参有限责任公司提供。四年生白参是从大连富生制药有限公司購买的。人参的真实性是根据成分配方确定的。黑参在85 ℃下通过9个循环反复蒸煮白参8 h并在50 ℃下干燥48 h制备。为了制备人参提取物，将黑参粉碎成粉末，并用10倍体积的蒸馏水，在80 ℃ 72 h萃取1次，然后过滤并冷却。人参提取物用酵母菌（丹麦格林纳拉勒曼德）在34 ℃下发酵25 h。发酵后，将黑参提取物在85 ℃灭菌22 h，然后冻干。本研究中使用的黑参提取物中的人参皂苷Rg2，Rg3，Rh1，Rh2和Rf分别为2.86 mg/mL，24.52 mg/mL，12.62 mg/mL，0.63 mg/mL和1.32 mg/mL[12]。

1.2.2 检测指标与方法

评估对顺铂所致肾细胞损伤的保护作用：使用LLC-PK1细胞评估对抗氧化肾细胞损伤的保护作用[12-13]。LLC-PK1细胞从美国典型培养物保藏中心购买，并在空气中含5%的CO2和37 ℃的环境中培养含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和4 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养基。将每空1×10个细胞接种在96孔培养板中，并使其粘附2 h。然后，将试验样品、自由基供体25 μmol/L顺铂或两者均加入培养基中。培养24 h后，除去含有测试样品、自由基供体或两者的培养基。在37 ℃将细胞在无血清培养基（90 mL/孔）和Ez-Cytox试剂（10 mL/孔）中培养2 h。通过使用酶标仪测量450 nm处的吸光度来测定细胞活力。

蛋白印迹分析：全细胞提取物制备按照制造商的说明使用放射免疫沉淀测定缓冲液，以 mmol/L苯甲基磺酰氟作为辅助。蛋白质（全细胞提取物，20 mg/泳道）在预制4-15迷你PROTEAN TGX凝胶电泳分离后涂抹到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并利用表位特异性原发性和继发性抗体进行分析。使用增强的化学发光预先蛋白质印迹检测试剂和Fusion Solo化学发光系统以显现结合的抗体。

基于图像的流式细胞仪测定：LLC-PK1细胞用于基于图像的凋亡测定系统。所有测定均按照用于操作Tali图像的细胞仪的指南进行。细胞在37 ℃，5%CO2的环境下用样品处理24 h。使用TrypLE试剂通过胰蛋白酶处理后收获细胞，并使用Tali凋亡试剂盒进行染色。对样本进行独立划分和分析并按照制造商推荐的协议使用Tali图像和流动细胞仪厂家。通过用膜联蛋白VAlexa Fluor 488缀合物染色测定细胞群的凋亡部分。碘化丙啶（PI）用于从凋亡细胞（Annexin V阳性/PI阴性）分化死细胞（膜联蛋白V阳性/PI阳性或膜联蛋白V阴性/PI阳性）。由Tali式细胞仪测出存活的、凋亡的和死亡的细胞群的百分比与来自同一样品独立运行的流式细胞仪上的数据是类似的[14-15]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。用多重比较检验和方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在本研究中，我们试图确定黑参提取物及其活性人参皂苷20（S）-Rg3的肾脏保护作用以及所涉及的机制，以确定其治疗潜力。我们进行了基于细胞的肾脏保护试验，以评估黑参提取物和人参皂苷20（S）-Rg3对LLC-PK1细胞的保护作用。使用LLC-PK1细胞系建立肾细胞保护试验条件，该细胞系通常用于评估肾毒性[16-17]。用25 μmol/L的顺铂治疗后，控制LLC-PK1细胞存活率降低到60%。使用黑参及人参皂苷20（S）-RG3后，由顺铂导致降低得细胞存活率明显恢复（图1）。黑参提取物和人参皂苷20（S）-Rg3分别控制在500 mg/mL和250 mg/mL水平改善了顺铂导致的肾毒性。

正常的MAPK信号转导的失调与急性与慢性肾脏疾病有关[18]。在本研究中，我们试图确定MAPKs-p53-caspase凋亡级联在介导黑参和人参皂苷20（S）-Rg3对肾细胞中氧化细胞毒性的保护作用中所扮演的成分。如图2所示，顺铂治疗24 h后，观察磷酸化氨基末端激酶在用黑参及人参皂苷20（S）-RG3处理后下降。然而，p-ERK和p-P38没有明显的变化（数据未显示）。

顺铂诱导的肾毒性依赖于DNA损伤诱导的细胞凋亡。p53的蛋白水平在使用顺铂治疗后显着增加，而经高浓度的黑参及人参皂苷20（S）-RG3治疗后大幅减少。类似地，用黑参和人参皂苷20（S）-Rg3处理后，升高的切割的半胱天冬酶-3水平也降低了。图3显示黑参提取物和人参皂苷20（S）-Rg3对LLC-PK1细胞凋亡的影响。如图3A所示，使用顺铂治疗后，被红绿荧光染色的凋亡及死亡细胞的数量增加了，其数量在经黑参尤其是与人参皂苷20（S）-RG3联合治疗后降低。用黑参和人参皂苷20（S）-Rg3进行联合治疗后，顺铂治疗诱导的凋亡LLC-PK1细胞升高百分比明显降低（图3B）。

3 讨论

人参皂苷是三萜烷磺酸衍生的30碳糖苷，是人参的主要活性成分。人参皂苷抑制正常大鼠肾细胞中斑蝥素诱导的细胞毒性。人参皂苷经预处理降低了大鼠血清肌酐，尿蛋白，血尿素氮和组织学变化的增加[19]。这些结果可能反映了某些人参皂苷可改善药物性肾毒性肾功能不全。

顺铂诱导的肾损伤与自由基和氧化应激的形成有关，这种损伤可激活MAPKs[20-22]。用抗氧化剂和胱天蛋白酶抑制剂治疗可以缓解顺铂相关肾毒性的作用。有相当多的证据表明该蛋白激酶、p53和半胱天冬酶途径在凋亡途径的调控以及炎性反应过程中发挥重要作用。本研究结果表明JNK-p53-caspase-3信号级联在介导黑参人参皂苷20（S）-Rg3对培养的LLC-PK1细胞中氧化细胞毒性的保护作用方面起关键作用。

人参通过减轻包括超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶在内的抗氧化酶的活性以及谷胱甘肽的水平，显示出对顺铂诱导的肾毒性的保护作用。这种效应从而降低了氧化应激、生化指标的改变、组织学改变、基因组DNA损伤、以及表达TNF-a、白细胞介素6、肿瘤抑制基因p53等指标。人参皂苷F11经预处理降低了顺铂诱导的血尿素氮和肌酐水平的升高，改善了组织病理学损伤。进一步的研究表明，F11抑制p53的活化，反转了B细胞淋巴瘤2相关X蛋白/B细胞淋巴瘤-2的比例，顺铂诱导的抗氧化和自由基水平反过来抑制了肾小管细胞凋亡[23-24]。然而，人参皂苷20（S）-Rg3的效果和作用机制到目前为止尚未确定。

总之，我们的研究结果表明，人参皂苷20（s）-Rg3可改善LLC-PK1的细胞毒性，人参皂苷20（S）-RG3可能是通过阻断JNK-P53-caspase-3信号级联反应来介导这种作用的重要组成部分。

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