不同酶标抗体稀释液对酶标抗体稳定性的影响

摘 要： 为筛选一种较好的酶标抗体稀释液，试验以磷酸盐缓冲液（PBST）为基础溶液，通过添加甘油、酪蛋白、海藻糖及防腐剂Proclin 300等试剂配制了4种不同组合的酶标抗体稀释液，分别在4℃和37℃条件下考察其对酶标抗体稳定性的影响。结果表明，处理5（0.01 mol/L PBST+3%酶稳定剂M+3%海藻糖+0.05%Proclin 300）的保护效果最好，在4℃保存6个月，酶标抗体的活性仅降低18%。

关键词： 保护剂；酶标抗体；稳定性；海藻糖；甘油；酪蛋白

中图分类号： S852.4 文献标识码： A 文章编号： 1006-060X（2014）14-0001-02

Stability of Enzyme-Labelled Antibody in Its Different Diluents

LI Ya-pu

（Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences， Shijiazhuang 050081，PRC）

Abstract： In this study， four different combinatorial enzyme-labelled antibody diluents prepared with the PBST buffer solution as a basis to which glycerol， casein， trehalose or / and Proclin 300 reagent was added were used to investigate the effect of the four diluents on the stability of enzyme-labelled antibody at 4 ℃ or 37 ℃， respectively， in order to screen a better enzyme diluent for the enzyme-labelled antibody stability. The results show that the treatment 5 （0.01 M PBST + 3% enzyme stabilizer +3% trehalose + 0.05% Proclin 300） was of the optimal protective effect and could be kept at 4 ℃ for 6 mon so that the activity of the enzyme-labelled antibody therein reduced by only 18%.

Key words： protective agent； enzyme-labelled antibody； stability； trehalose； glycerol； casein

酶标抗体在-20℃及以下温度能够保存一年甚至更长时间，但是商品化的试剂盒一般都要求酶标抗体在常温或4℃条件下保存，并且保存期至少半年时间。ELISA试剂盒进行商品生产的关键技术之一是使试剂盒在保存期内酶标抗体的免疫活性不发生变化。为了适应市场的需要，笔者通过添加几种不同的保护剂于酶标抗体稀释液中，研究了不同的保护剂组合对酶标抗体稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大豆材料来自于河北省农科院粮油所大豆室。供试试剂：辣根过氧化物酶（HRP）、吐温-20 、甘油（Solarbio Reagent Grade）；酶稳定剂M、酶联稀释液（泰天和生物）；BSA、酪蛋白、海藻糖（均购自Sigma）；防腐剂Proclin 300（上海闪晶生物）；过碘酸钠、乙二醇、硼氢化钠、硫酸铵（均为分析纯试剂）、超纯水（自制）。供试仪器：移液枪、洗板机（Thermo）、酶标仪（美国Bio-TEK）、37℃恒温培养箱（SANYO公司）、低温离心机（HITACHI）、酶标板（Costar）。

1.2 试验方法

1.2.1 辣根过氧化物酶（HRP）标记单克隆抗体 采用改良过碘酸钠法进行抗体标酶[1-2]：称取适量的HRP，溶于超纯水中，加入新鲜配置的过碘酸钠溶液，混匀后于4℃下静置30 min；加入乙二醇溶液，室温放置30 min；加入适量纯化的抗体，混匀用碳酸盐缓冲液调pH值至9.0，4℃过夜；加入硼氢化钠，混匀，4℃静置2 h；然后将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀于4℃下静置30 min，离心取沉淀，用0.02 mol/L pH值7.4的磷酸盐缓冲液（PBST）透析过夜，取出即为标酶的抗体溶液。

1.2.2 酶标抗体工作浓度的测定 采用间接ELISA法测定酶标抗体的最佳工作浓度，以脂氧酶-3的抗原包板，确定该酶标抗体最高的稀释倍数，以3%和10%的BSA包板确定该酶标抗体最低的稀释倍数，采取方阵滴定法测定酶标抗体的实际工作浓度。

1.2.3 不同组合的酶标抗体稀释液对酶标抗体稳定性的影响 将适量酶标抗体分别添加到5种不同组合的酶标抗体稀释液中，分别标记为处理1（北京泰天和的酶联稀释液，将酶标抗体稀释直接使用）、处理2（0.01mol/L PBST+10%甘油）、处理3（0.01mol/L PBST+10%酪蛋白+0.05%Proclin 300）、处理4（0.01 mol/L PBST+10%酪蛋白+3%海藻糖+0.05%Proclin 300）、处理5（0.01 mol/L PBST+3%酶稳定剂M+3%海藻糖+0.05%Proclin 300）。将以上5种配方保存的酶标抗体分成2组，分别存放于4℃冰箱和37℃温箱中，定期取出考察它们的稳定性。放于4℃冰箱的稀释液每30 d取出测定一次，共测定6个月；放于37℃保温箱的稀释液每1 d取出测定一次，共测定5 次。

试验方法采用抗原抗体直接反应法，在酶标板上直接包被LOX-3抗原，4℃过夜。取出包被的板条事先在室温进行稳定，洗板3次，然后将需要测定的酶标抗体稀释液放于孔中，每孔100 L，37℃温箱30 min，洗板3次后加显色液，15 min后加入终止液，酶标板读数测定OD值。

2 结果与讨论

2.1 酶标抗体最佳工作浓度的测定

采用间接ELISA法测定酶标抗体的最佳工作浓度，以脂氧酶-3的抗原包板，确定该酶标抗体最高的稀释倍数1∶800 000，以3%和10%的BSA包板确定该酶标抗体最低的稀释倍数1∶3 200，方阵滴定法测定酶标抗体在ELISA试剂盒中实际的工作浓度为1∶5 000，这样既可以节省酶标抗体，又可以使该酶标抗体在酶标稀释液中可以较长时间保存。

2.2 不同保护剂组合对酶标抗体稳定性的影响

由表1可知，5种不同组合的保护剂对制备的酶标抗体都有一定的保护作用。对新制备的酶标抗体经过5种不同组合的保护剂处理进行间接ELISA测定，处理1～5的结果分别为2.221、1.866、2.131、2.378和2.363。

5种不同的酶标抗体稀释液经过4℃处理和37℃加速处理，酶标抗体的活性都有不同程度的下降。对比以上两组数据可知，5种不同的稀释液在上述两种处理条件下呈现出基本一致的下降趋势。其中，处理2和处理3下降较快，30 d后酶标抗体基本上就没有活性了，这表明这两种配方的保护液对酶标抗体基本上没有保护性。处理1和处理5的保护液配方对酶标抗体有较好的保护作用，因为处理1的保护液是由北京泰天和生产的，具体的配方成分不清楚，而处理5的保护液是自配的，具有与处理1保护液相似的保护性，并且保护性良好，因此选择处理5的保护液作为该酶标抗体的保护液。根据Arrhenius equation 的37℃ 存放1 d 相当于2～8℃存放1.5 个月的推论[3]，该酶标抗体稀释液在4℃保存6个月，相当于37℃加速试验的第4天，处理5的酶标抗体稀释液在4℃保存6个月，其活性降低了18%，而在加速试验的第4天，其活性降低了16.7%，二者下降率均在20%以内。

3 讨 论

传统的酶标抗体稀释液常用高浓度的无关蛋白或者动物血清来作稳定剂，但其保护效果并不理想，现配现用可以，但是保存一段时间就失效了。海藻糖被誉为生命之糖，当生物体受到不良环境条件胁迫时，它能保护生物大分子结构和功能的稳定，维持生物体的正常生命活动。因此参考他人文献[4-5]，选用了甘油、酪蛋白、海藻糖及防腐剂Proclin 300等几种试剂作稳定剂，基础溶液为0.01mol/L的PBST，以上一种或几种试剂相互配合，筛选出了一种适合的酶标抗体稀释液。但是该酶标抗体稀释液还不尽完美，因为经过半年的保存期，酶标抗体的活性下降超过了10%，因此仍需要对几种试剂的比例进行调整，使得酶标抗体经过半年的保存期，活性下降控制在10%以内。

参考文献：

[1] 骆加理，沈炳贵，宋光承，等. 辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体的简易方法[J]. 生物化学与生物物理学报，1981，13（1）：1-7.

[2] 张趁华，蔡家利. 兔抗小鼠 IgG-HRP 酶标抗体的制备及应用[J]. 莆田学院学报，2011，18（2）：19-23.

[3] Geoffrey A，Milda S. Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse[J]. Clinical Chemistry，1991，37：398-401.

[4] 胡慧芳，马有会. 海藻糖的最新研究进展[J]. 辽宁农业职业技术学院学报，2009，（9）：26-28.

[5] 李新华. 酶免疫测定中酶标记抗体保存条件的研究[A]. 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C]. 北京：中国畜牧兽医学会，2002：632.

（责任编辑：成 平）

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