当归挥发油给药大鼠尿液比较代谢组学研究

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[摘要] 为了分析当归挥发油（Angelica sinensis volatile oil， ASVO）对正常大鼠尿液代谢产物的影响，揭示ASVO影响大鼠体内代谢的可能途径。该实验将50只雄性Wister大鼠随机分成空白对照组、ASVO高（0.352 mL·kg^-1）、中（0.176 mL·kg^-1）、低剂量（0.088 mL·kg^-1）组和阿司匹林（aspirin， ASP）对照组，每组10只，分别给予生理盐水和高、中、低剂量的ASVO及ASP各0.2 mL，连续给药3 d，并利用大鼠代谢笼收集各组大鼠12，24，36，48 h的尿液，应用GC-MS检测不同时段的大鼠尿液代谢指纹图谱，采用主成分分析（principal component analysis， PCA）方法和正交偏最小二乘分析方法（orthogonal partial least-squares discriminant analysis， OPLS-DA）分析，通过变量重要性投影（vriable importance in the projection， VIP）和T检验筛选潜在生物标志物。结果显示，ASVO中剂量组在36 h时对大鼠尿液代谢物影响最大。与空白对照组相比，ASP组与ASVO给药组大鼠尿液中7种代谢物有显著变化（P<0.05），其中乌头酸、琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、甘氨酸、苹果酸的含量呈升高趋势（P<0.05），前列腺素含量呈下降状态（P<0.01），认为ASVO与ASP的作用机制具有相似性。它们对体内代谢的影响可能主要集中于能量代谢、氨基酸代谢以及脂质代谢途径。大鼠灌胃ASVO后可提高机体的能量代谢，抑制炎性物质的产生、增强机体的免疫能力，该结果为进一步阐释ASVO药理作用提供了依据。

[关键词] 当归挥发油；代谢组学；GC-MS；潜在生物标志物

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis Oliv.Diels的干燥根，多年生草本植物^[1]，主产于甘肃岷县、漳县、渭源等地，是甘肃的道地药材之一。其中当归挥发油（A. sinensis volatile oil， ASVO）是当归的主要成分之一，研究发现当归挥发油主要化学成分为Z-藳本内酯78.61%， Z-丁烯基酞内酯7.99%， E-藳本内酯1.66%，E-丁烯基酞内酯1.29%等^[2]；ASVO在临床上已广泛应用于镇痛抗炎、平喘、增加机体能量和增强机体免疫功能等。近代研究中代谢组学已广泛应用于中药成分及中药作用机制的研究^[3-4]，固本研究采用代谢组学技术^[5-7]，分析阿司匹林（aspirin， ASP）和ASVO给药组与空白对照组大鼠尿样，并比较给药组内源性代谢产物的变化，以期阐明ASVO的作用机制。

1材料

1.1仪器与设备

Thermo ITQ700（美国热电）气相色谱-质谱联用仪、 Thermo TR-5MS毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）（美国热电），YP1102H型分析天平（上海精密科学有限公司），加样器（Eppendorf公司），挥发油提取器（天津市天玻玻璃仪器有限公司），TBZ5-WS 多管架自动平衡离心机（湘仪），KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超市仪器有限公司），真空干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）。

1.2药品与试剂

叠氮钠、阿司匹林，购自上海中秦化学试剂有限公司；吡啶、乙腈、甲醇均为色谱纯试剂，购自美国Tedia 公司；甲氧胺盐酸盐、[N-甲基-三甲基硅烷-三氟乙酰胺（MSTFA）]-[三甲基-氯硅烷（TMCS）]100∶1均购自瑞士Fluka公司。当归购于甘肃岷县，经甘肃农业大学动物医学院中兽医教研室魏彦明教授鉴定为A.sinensis。

1.3动物

Wistar雄性大鼠50只，体重180～220 g，动物生产合格证号SCXK（甘）2009-004，购自兰州大学医学院实验动物中心。

2方法

2.1当归挥发油的提取及配制

准确称取当归200 g，粉碎后过40目筛粉粒，加入约1 000 mL蒸馏水，混于3 000 mL圆底烧瓶中，提前浸泡1 d。圆底烧瓶上接挥发油提取器、冷凝管，置于电热套50 V电压中，微沸腾后开始计时，提取8 h。将提取好的挥发油样品装入2 mL EP管中备用，用无水硫酸钠（Na₂SO4）脱水，密封保存于4 ℃冰箱中备用^[8-9]。给药前用0.5%的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）配成所需浓度的ASVO溶液^[10]。

2.2分组及给药

50只雄性Wistar大鼠，在12 h充足光照、12 h黑暗，适合温度，适宜湿度条件下适应性饲喂5 d。然后按体重将大鼠随机分为5组，即空白对照组、ASVO高剂量组、ASVO中剂量组、ASVO低剂量组、ASP对照组，每组10只。给药方式为灌胃，每组大鼠的给药容积2 mL，每天早上灌胃1次，灌胃剂量见表1，连续灌胃3 d。

2.3尿液采集和处理

采用代谢笼，从第一次灌胃开始收集尿液，分别收集灌胃后12，24，36，48 h尿液，3 000 r·min^-1离心10 min，加100 μL的叠氮钠，保存于-80 ℃冰箱中。

实验前取-80 ℃下保存的尿液样品，在常温下解冻溶解。取100 μL解冻后的样本，再加入250 μL乙腈沉淀蛋白，然后在冰浴条件下冷却超声10 min后在离心机中离心分离（1万 r·min^-1， 10 min），取离心后上清液250 μL至1.5 mL离心管中，在40 ℃真空干燥箱中挥发至干。加入50 μL 15 g·L^-1甲氧胺吡啶溶液，充分混匀，在70 ℃条件下进行1 h肟化处理，加入50 μL衍生化试剂[VMSTFA-VTMCS 100∶1）]进行衍生化，混匀，离心分离（1万 r·min^-1， 10 min），吸取离心后上清至微量进样管，用于GC-MS分析。

2.4GC-MS条件

进样量1 μL；进样口温度270 ℃；接口温度270 ℃，离子源（EI）温度230 ℃；电离电压70 eV；分流模式不分流进样；载气氦气；初始温度85 ℃；柱子最高温度280 ℃；升温程序85 ℃（保留5 min），以10 ℃·min^-1匀速升温至220 ℃，以3 ℃·min^-1匀速升温至280 ℃，溶剂延迟9 min；全扫描模式，扫描范围m/z 60～600。

2.5数据分析

将各尿液样品通过GC-MS分析后所得的数据，采用色谱工作软件进行峰提取、峰对齐及峰面积积分等处理，以二十二烷为内标计算相对峰面积，处理后的数据导入SIMCA-P（v12.0，瑞典Umetrics公司）进行分主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），采用SPSS 17.0软件进行T检验，检验差异代谢物组间差异的显著性（P<0.05）。

3结果

3.1各组大鼠尿液GC-MS代谢指纹谱宏观比较

12 h时ASVO不同给药组、ASP对照组、空白对照组经GC-MS分析，得出大鼠尿液代谢指纹图谱，见图1。从图中可以看出各ASVO给药组和ASP对照组与空白对照组比较均表现出一定的差异，其中ASP对照组与空白对照组的差异主要集中在12～22 min 和30～40 min；ASVO高、中、低剂量组与空白对照组均在12～23 min以及27～40 min出现明显差异；且宏观观察ASVO给药组与ASP对照组的变化图谱具有一定的相似性，说明这2组受试品对内源性物质的代谢干扰可能存在着相同的机制，能够满足比较代谢组学分析要求。

3.2通过大鼠尿液代谢物差异寻找最佳给药时间与剂量

3.2.1各组大鼠尿液代谢表型的经时变化分析 采用OPLS-DA方法对各组大鼠尿液进行代谢表型经时分析，见图2～4，各组样本点较好的聚合在一起，ASVO高、中、低剂量组和ASP对照组样本点均与空白对照组完全分离，ASVO给药组围绕在ASP对照组周围，说明ASP和ASVO明显的干预了大鼠尿液中的代谢物，且ASVO高、中、低剂量组与ASP对照组具有一定的相似性，这与以上指纹图谱分析 组的时间点的差异比较发现，给药36 h时，ASVO中剂量组与空白对照组的均值样本距离较其他时间的距离大很多。更进一步确定在灌胃ASVO 36 h时，它对大鼠尿液中的代谢物的影响强于比其他时间点。所以，采用ASVO中剂量组第36 h的数据研究其对大鼠尿液代谢物的影响，并从中鉴定潜在生物标志物。

3.3通过寻找潜在标志物分析ASVO对大鼠尿液代谢物的影响机制

3.3.136 h ASVO中剂量组与ASP对照组代谢图谱数据的PCA分析 采用PCA分析方法对大鼠灌胃36 h 时ASVO中剂量和ASP对照组与空白对照组代谢物数据进行分析^[11-13]，得分图见图6，7。从图中可知，空白对照组和36 h中剂量ASVO组各样本点聚类特征良好，且空白对照组和ASVO组不存在样本点的重合；同样ASP对照组与空白对照组各样本点聚类特征良好，不存在重合样本点；中剂量 ASVO组样本点比ASP对照组距空白组远。更进一步表明36 h中剂量ASVO组以及ASP对照组的大鼠尿液中的代谢物与空白对照组之间有明显差异，

3.3.2潜在生物标志物的鉴定及其含量变化 根据OPLS-DA模型中变量重要性投影值（VIP值），选择了VIP>1的差异变量，再运用SPSS 17.0中单因素方差分析生物标志物的含量变化是否存在显著性差异，P<0.05的差异变量才属于潜在生物标志物^[14-15]。利用 NIST 质谱数据库对生物标志物进行鉴定^[16-17]。最后从ASVO各组和ASP对照组大鼠尿液中鉴定出7个潜在生物标志物，为乌头酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸、α-酮戊二酸和前列腺素，其中ASVO中剂量组和ASP对照组潜在标志物及其含量见表2。2组大鼠尿液中内源性代谢物乌头酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、甘氨酸和α-酮戊二酸的含量与空白对照组比较均显著上升（P<0.05，P<0.01），前列腺素含量显著下降（P<0.01）。从表2中也可以看出给药后ASVO中剂量组尿液潜在标志物含量变化明显高于ASP对照组。

4讨论

ASVO具有抗炎^[18]、避免细胞损伤^[19]、扩张血管，改善器官血流量、抗肿瘤及增强免疫功能^[20-21]的作用， 近代医药学研究表明ASP也具有镇痛、解热、抗炎、抗风湿及对血小板聚集的抑制作用^[22]。为进一步探讨ASVO的药用机制，本研究以ASP作为对照，以生物标志物为评价指标，对比评价ASVO的抗炎作用和作用机制。结果显示与空白对照组相比，ASP组与ASVO组大鼠尿液中乌头酸、琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、甘氨酸、苹果酸和前列腺素7种代谢物发生明显变化。

本研究发现的ASP对照组和ASVO给药组大鼠尿液中共有的乌头酸、琥珀酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、甘氨酸、苹果酸和前列腺素7种潜在生物标志物与ASVO及ASP的药理作用及作用机制相关。生物学功能已经明确的小分子化合物乌头酸、琥珀酸、苹果酸和柠檬酸都是三羧酸循环（TCA）的反应物或中间产物。TCA是生物体内极其重要的代谢途径，糖、脂肪、氨基酸的有氧分解代谢都汇集在TCA的反应中，其循环代谢的中间产物又是许多生物合成途径的起点^[23]，TCA循环的状况是机体能量代谢水平的综合反映。研究发现各给药组大鼠尿液中这几种物质相对空白对照组含量上升，表明大鼠灌胃ASVO和ASP机体的能量代谢作用增强。潜在标志物甘氨酸、α-酮戊二酸含量升高，前列腺素含量下降。其中甘氨酸是动物机体内最简单的氨基酸，是机体内源性抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）的组成氨基酸， 参与机体内糖类物质代谢以及三羧酸循环，甘氨酸含量升高进而可增加机体的能量^[24]。研究还发现甘氨酸可以抑制炎性因子的产生、促进抗炎因子的增加，可防止各种有毒物质对细胞的损伤^[25]；而α-酮戊二酸也是TCA中的一种重要中间产物，具有谷氨酰胺（Gln）碳架，经转氨形成谷氨酸，再进一步氨基化形成Gln，水解后增加机体能量^[26]。在血液中Gln的含量也很丰富，作为一种生糖氨基酸， 可以合成肝糖原，是淋巴细胞增殖、分泌及维持其功能所必须的，具有增强免疫反应的作用。甘氨酸和α-酮戊二酸在大鼠尿液中含量升高表明大鼠机体的能量代谢增强、氨基酸代谢出现异常，灌胃ASVO及ASP可以通过控制炎性因子及抗炎因子的产生提高大鼠机体的免疫能力，从而维持大鼠机体的稳态。前列腺素前体是花生四烯酸（AA），AA是生物体内的必需脂肪酸，当细胞膜受到刺激时，生物体内游离的AA在环加氧酶（COX）的作用下，在肝中进一步代谢为前列腺素。前列腺素作为体内十分重要的炎症介质，参与机体免疫及炎症反应过程，大鼠灌胃ASVO及ASP后尿液中前列腺素含量下降，说明ASVO可通过阻断前列腺素在体内的产生来发挥抗炎作用。

通过对ASVO及ASP灌胃后大鼠尿液中的代谢物变化比较得出，给药后大鼠的代谢轮廓均发生了变化，并且不同浓度的ASVO对大鼠尿液中的代谢物影响程度不一样，中剂量ASVO在36 h时对大鼠尿液代谢物影响最大。与ASP对照组相比较，ASVO组大鼠尿液离子流图、内源性物质PCA分析及潜在标志物含量变化趋势均具有相似性，且中剂量ASVO对大鼠尿液代谢物含量的影响大于ASP。进一步表明了ASVO具有与ASP相似的药理作用。

综上所述，ASVO与ASP具有相似的药理作用，具体表现在增加机体能量、抗损伤、抗炎及增强免疫能力等作用；另外对潜在生物标志物含量变化及其趋势的研究证明大鼠灌胃ASVO对体内的代谢影响可能主要集中于能量代谢、氨基酸代谢以及脂质代谢途径，研究不仅补充了ASVO的药物代谢和作用机制，还为其他中药药理作用深层次的研究提供了思路。

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Comparative metabonomics study on urine in rat treated by

Angelica sinensis volatile oil

LI Jin-xia， ZHANG Man， SUN Li-bo， ZHANG Ling， ZHANG Wen-quan， ZHAO Hai-fu，

LI Peng-ling， HUA Yong-li， JI Peng， WEI Yan-ming*

（College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

[Abstract] Metabonomics was employed to investigate the effect of Angelica sinensis volatile oil（ASVO）to the endogenous metabolites of normal rats， and to reveal the possible ways of metabolism in rats caused by ASVO. The fifty male Waster rats were randomly divided into five groups（each consists of 10 rats）， such as control group， high dose group of ASVO， middle dose group of ASVO， low dose group of ASVO， and Aspirin group. They were given 0.9% saline， 0.352 mL·kg^-1 ASVO， 0.176 mL·kg^-1 ASVO， 0.088 mL·kg^-1 ASVO and ASP respectively with the equal volume of 0.2 mL. Drugs and vehicle were given for 3 successive days. The urine was collected at 12， 24， 36， 48 h after modeling with metabolic cages. Rat urine metabolic fingerprint in different stages was analyzed using GC-MS， based on which the principal component analysis（PCA）and orthogonal partial least-squares discriminant analysis（OPLS-DA）models were established for metabonomic analysis. Potential biomarkers were screened by using variable importance in the projection（VIP）and T test. It was revealed that the middle dose of ASVO at 36 h induces a substantial change in rat urine. Compared with control group， seven kinds of endogenous metabolites in ASP group and ASVO group change significantly（P<0.05）， among which aconitic acid， succinic acid， citric acid， α-ketone glutaric acid， glycine and malic acid content had an upward trend（P<0.05）and prostaglandin content had a downward trend（P<0.01）. The mechanism of ASVO and ASP have the similarity. It is likely that ASVO intervenes the metabolic process by affecting the energy， amino acid and lipid metabolism. Our work also indicates that rats administrated with ASVO can increase the energy metabolism of the body， induce the production of inflammatory substances and strengthen the body"s immune ability. The result has also provide a proof for futher interpret ASVO pharmacological effects.

[Key words] Angelica sinensis volatile oil； metabonomics； GC-MS； potential biomarker

doi：10.4268/cjcmm20140728

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