蛋白质的糖基化作用及其在生物制药中的应用

【摘 要】糖基化是蛋白质一种十分重要的翻译后修饰，对蛋白质的结构和功能有着重要影响。本文对蛋白质糖基化修饰的种类以及蛋白质特性受到的糖基化修饰的影响进行了综述，并且以此为基础，对生物制药中蛋白质糖基化工程的应用和发展进行了分析和介绍。

【关键词】蛋白质；糖基化；生物制药

糖基化（Glycosylation）是指蛋白质或脂质在酶的作用下被连接上糖链的过程。作为生物体内最为重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，糖基化调控了蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性[1-2]。大量的研究表明，糖基化修饰可以发生在细胞内50%到70%的蛋白质上，它们参与了包括细胞识别、细胞分化、发育、信号转导、免疫应答等在内的各种重要的生命活动。在多种疾病，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管病、代谢性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的发生发展中均伴随着蛋白质糖基化异常的发生[3]。而且作为一种主要的翻译后修饰，糖基化对蛋白质功能具有十分关键的影响。目前以糖基化蛋白质的特性为根据，通过糖基化工程已经能够在酵母中成功地表达人类糖蛋白，同时修饰目的蛋白的糖链还具有结构均一的特点，因此现在大规模生产糖基化蛋白类的药物已经成为可能。

1. 糖基化类型

蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质，和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。根据结合位点和结构的差异，糖链分为以下几种类型 ：⑴连接于天冬酰胺（Asparagine， Asn） 残基酰胺氮的 N-连接糖链（又称N-糖基化）；⑵连接于丝氨酸（Serine， Ser）、苏氨酸 （Threonine， Thr）残基羟基氧的 O-连接糖链（又称O-糖基化）；⑶与磷酸丝氨酸上的磷酸连接的糖链；⑷连接于色氨酸（Tryptophan， Trp）残基上碳的C-连接糖链（C-糖基化，很少见）；⑸糖基磷脂酰肌醇化。其中，N-糖基化在真核生物中广为存在，也是研究最为深入的一种糖基化方式[3]。

1.1 N-糖基化

糖链通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH2基共价连接，将这种糖基化称为N-糖基化。N-连接的糖链合成起始于内质网（ER），完成于高尔基体。N-糖链合成的第一步是将一个14糖的核心寡聚糖添加到新形成的特征序列为Asn-X-Ser/Thr（X代表任何一种氨基酸）的多肽链的天冬酰胺残基上，天冬酰胺作为糖链受体。核心寡聚糖是由2分子N-乙酰葡萄糖胺、9分子甘露糖和3分子葡萄糖依次组成，第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合，当ER膜上有新多肽合成时，整个糖链一起转移。寡聚糖转移到新生肽以后，在ER中进一步加工，依次切除3分子葡萄糖和1分子甘露糖。在ER形成的糖蛋白具有相似的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜囊之间的转运过程中，原来糖链上的大部分甘露糖被切除，但又由多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。血浆等体液中的蛋白质多发生N-糖基化，因此N-糖蛋白又称为血浆型糖蛋白。

1.2 O-糖基化

O-糖基化：糖链与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的自由OH基共价连接。O-糖基化位点没有保守序列，糖链也没有固定的核心结构，组成既可是一个单糖，也可以是巨大的磺酸化多糖，因此与糖基化相比，O-糖基化分析会更加复杂。O-连接的糖基化在高尔基体中进行，通常第一个连接上去的糖单元是N-乙酰半乳糖，连接的部位为Ser、Thr或Hyp的羟基，然后逐次将糖残基转移上去形成寡糖链，糖的供体同样为核苷糖，如UDP-半乳糖。O-糖蛋白主要存在于黏液和免疫球蛋白等。

1.3 C-糖基化[4]

一分子甘露糖基通过C-C键连接到色氨酸吲哚环2号位C上 以此形式修饰蛋白质。这种糖基化多发生在W-X-X-W W-X-X-C或者W-X-X-F序列的第一个色氨酸残基上。在生命体中这种糖基化很少见。

1.4 糖基磷脂酰肌醇化

GPI糖基磷脂酰肌醇化：是蛋白与细胞膜结合的唯一方式，不同于一般的脂类修饰成分，其结构极其复杂。许多的细胞受体、分化抗原以及具有一些生物活性的蛋白都被证实通过GPI结构与细胞膜结合。GPI的核心结构由乙醇胺磷酸盐、三个甘露糖苷、葡糖胺以及纤维醇磷脂组成。GPI锚定蛋白的C末端是通过乙醇胺磷酸盐桥接于核心聚糖上，该结构高度保守，另有一个磷脂结构将GPI锚连接在细胞膜上。核心聚糖可以被多种侧链所修饰，比如乙醇胺锚酸盐基团、甘露糖、半乳糖、唾液酸或者其他糖基。

2. 蛋白质糖基化工程概述[5]

所谓蛋白质糖基化工程 ，就是通过对蛋白质表面的糖链进行改造 ，从而改良蛋白质性质的一种技术。常用的对糖链进行改造的方法有：（1）通过定点突变技术增加或减少蛋白质的糖基化位点，从而增加或减少蛋白质表面的糖链。（2）在体外通过化学法或酶法对糖链进行修饰。（3）由细胞内一系列糖苷酶和糖基转移酶组装成糖基化途径（glycosylation pathway）来催化蛋白质的糖基化。通过基因工程手段改变宿主细胞内糖基化途径中糖苷酶和糖基转移酶的表达 ，即可改变在该系统中表达的糖蛋白的糖基化形式。目前已通过该方式对酿酒酵母、 巴斯德毕赤酵母、昆虫细胞、CHO细胞及转基因植物等多个表达系统进行了糖基化工程的改造。（4）研究表明，细胞培养条件也会影响到糖基化，所以利用细胞培养过程中培养基的氨离子、激素以及糖分浓度等条件的改变可以使蛋白质的糖基化得以改变。

3. 糖基化工程在生物制药中的主要应用

3.1 糖基化作用对蛋白质溶解性和稳定性受的影响

在面对各种变性条件时，由于糖基化能够有效的避免蛋白质的相互聚集，蛋白质的稳定性会而得以增强。与此同时，一些蛋白质分子中的蛋白酶降解位点也会由于蛋白质表面糖链的空间作用而被覆盖，使蛋白质对蛋白酶的抗性得以增强。有报道显示[6]，糖基化的IL-5与IFN-β相对于未糖基化的形式而言具有更强的对热变性作用的抗性。还有一些研究证明[7]，蛋白质分子的溶解性也会由于蛋白质表面的糖链而增加。通过糖基化工程使天然的与5个N-连接糖链连接上的时候就会增加15倍的溶解度。与此同时，在对恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP-1糖基化和未糖基化的形式进行对比研究的时候发现，相对于未糖基化MSP-1而言，糖基化MSP-1具有远高于前者的溶解度[8]。研究表明[9]，经过糖基化修饰后氯霉素的水溶性增加的十分明显，同时也能够对药物的吸收利用起到有效的促进作用，也可以使原药的毒副作用得以有效降低。

3.2 糖基化作用对蛋白药物药效学与药物动力学的的影响

蛋白质药物的分子质量会由于蛋白质的糖基化作用而增加，使药物分子在肾小球的滤过率减少，从而有效地控制药物的清除率，延长半衰期。有报道证明[10]，相对于未糖基化的人促红细胞生成素（EPO），其高度糖基化类似物具有非常接近的稳定性和结构性。然而仅仅因为其33和88位的氨基酸残基各增加了一个N-糖基化位点，因此在实验动物体内体内该类似物的半衰期延长了3倍。还有报道证实[11]，促卵泡激素的高度唾液酸化亚型的体内活性和肾脏清除率比野生型更低。

3.3 组织靶向性与糖基化作用

甘露糖受体属于一种多凝集素受体，为巨噬细胞和树突状细胞所特有，能够对病原体细胞壁以及细胞表面上的多种糖分子进行识别，参与到受体介导的吞噬作用以及内吞作用中，有效地结合获得性免疫和天然免疫，构成机体的免疫防御系统，对机体内环境的稳定起到保护作用。通常靶向化甘露糖受体的疫苗划分为两种，一种是基于甘露糖受体自然配体的疫苗，还有一种是基于甘露糖受体的抗体的疫苗[12]。现在甘露糖受体靶向化技术的不断进步使得机体的免疫应答以及抗原的特异性得以显著提升。

3.4 机体免疫反应以及蛋白质免疫原性受到的糖基化作用的影响

机体的免疫与蛋白质的糖基化修饰具有十分密切的关系，在药物研制以及疾病诊断治疗方面糖基化的研究具有重要的意义。首先特定的免疫反应会由于白质表面的糖链而被诱发出来，细胞表面的糖链长期依赖都被人们认为具有分子天线的作用，其能够对抗原与抗体、细胞等进行有效的识别[7]。其次通过对蛋白质表面的某些表位的遮盖，糖链能够使其免疫原性得以降低。比如，在去糖基之后，重组人红细胞生成素能够增强单纯红细胞再生障碍患者的机体免疫反映，这就表明蛋白质的潜在序列可以在糖链的保护作用下不会被免疫系统发现。

3.5 利用糖基化工程提升蛋白药物的靶向性[13]

高歇氏病（Gaucher"s）是由葡糖脑苷脂酶基因缺陷而导致的一种单基因遗传性疾病，是由于葡糖脑苷脂在网状内皮系统的巨噬细胞内堆积，引起巨噬细胞异常。异常的巨噬细胞（高歇氏细胞）转移后使相应的器官发生病变 ，从而产生肝脾肿大、骨骼疼痛、贫血、血小板减少等各种病理症状。葡糖脑苷脂酶是一种存在于溶酶体内的与溶酶体膜结合的糖蛋白，其底物为葡糖脑苷脂。

1965年，Braddy提出高歇氏病的酶替代疗法。向患者体内补充葡糖脑苷脂酶，降解高歇氏细胞内堆积的葡糖脑苷脂，就有可能使以上症状得到控制或消除。然而临床结果却显示，由于葡糖脑苷脂酶缺乏良好的针对巨噬细胞的靶向性，静脉注射的葡糖脑苷脂酶90 %都被肝细胞摄取降解，疗效十分有限。针对巨噬细胞的靶向性问题成了酶替代疗法亟需解决的关键问题。

有学者在1980年发现有一种甘露糖受体的膜蛋白存在于巨噬细胞的表面，能够与糖链末端为甘露糖的糖蛋白特异性的结合，并将它内吞进细胞里。根据这一发现，Genzyme公司通过糖基化的方法对人葡糖脑苷脂酶进行处理，使其暴露出甘露糖残基，从而增加了人葡糖脑苷脂酶针对巨噬细胞的靶向性，使得高歇氏病的酶替代疗法可以获得较好的治疗效果。

4. 结语

作为一种最为重要的也是最为常见的生物体蛋白质翻译后的修饰方式，糖基化会极大地影响到蛋白质的性状和功能。而且随着基因工程技术不断的发展，越来越多的药用重组糖蛋白已经制备出来，在相关疾病的临床治疗中扮演着重要角色。当今世界最前沿的生物学科之一就是糖生物学及蛋白质糖基化工程研究，可以预见在蛋白质改造中蛋白质糖基化工程将发挥越来越重要的作用。■

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