青藏高原放牧家畜小肠结肠炎耶尔森氏菌LAMP检测方法的建立及应用

材料与方法

1.1  材料

1.1.1  标准菌株与对照菌株。

耶氏菌标准菌株（ATCC23715），购自北京中科质检生物技术有限公司;对照菌株大肠杆菌（E.coli）、沙门氏菌（Salmonella）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）及蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），均由青海大学农学院动物医学系兽医传染病学实验室提供。

1.1.2  主要试剂及仪器。

1.1.2.1  试剂。改良磷酸缓盐冲液（PSB）培养基，购自杭州微生物试剂有限公司;细菌基因组快速抽提试剂盒，购自北京艾比根生物技术有限公司;粪便基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、核酸替代染料、6×Loading Buffer、DL-2 000 Marker、2×Taq PCR Master Mix，购自天根生化科技（北京）有限公司;Loopamp DNA扩增试剂盒（环介导等温扩增法）及Loopamp荧光目视检测试剂盒，均购自荣研生物科技（中国）有限公司。

1.1.2.2  仪器。实时浊度仪（型号为LA-320C），购自日本荣研化学株式会社;核酸蛋白测定仪（型号为Bio photometer plus），购自德国Eppendorf公司;核酸电泳仪（型号为DYY-12）购自于北京六一生物科技有限公司;凝胶成像分析系统（型号为6300），购自上海天能科技有限公司。

1.1.3  引物。

根据NCBI网站中GenBank数据库登录的耶氏菌的outL基因（登录号为CP009846.1），使用生物学软件MEGA7.0比对outL基因的保守序列，按照LAMP方法的引物设计原则，在线（http：//primerexplorer.jp/elamp 4.0.0/index.html）设计并筛选针对outL基因的引物序列（表1）。HPLC级引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4  标准菌株及对照菌株DNA。

纯培养的标准菌株（ATCC23715）和各对照菌株按照细菌基因组快速抽提试剂盒操作说明书提取细菌基因组DNA。

1.1.5  临床粪便样品DNA。

208份放牧牦牛、藏羊临床粪便样品分别采自青海省河南县、共和县、格尔木市、杂多县、久治县与及西藏那曲地区和日喀则市等地区。取1 g左右收集的粪便，置于5 mL灭菌PSB中，25 ℃下恒温摇床增菌培养24 h。然后，4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，收集沉淀，用于粪便基因组总DNA提取，粪便DNA提取按照粪便基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）操作说明书进行操作。

1.2  方法

1.2.1  LAMP检测的建立及条件优化。

按照Loopamp DNA扩增试剂盒推荐的体系建立耶氏菌LAMP检测方法。反应体系（总体积为25 μL）如下：DNA模板2 μL，2 × 反应缓冲液（RM）12.5 μL，5 pmol/μL 的F3、B3引物各1 μL，40 pmol/μL的FIP、BIP引物各1 μL，20 pmol/μL 的LAMP荧光检测试剂（FD）1 μL，BstDNA聚合酶1 μL，去離子水4.5 μL。反应程序如下：60 ℃反应60 min，80 ℃灭活5 min。

试剂盒推荐反应时间为30～60 min。为了保证充分地扩增，首先扩增60 min进行LAMP扩增。为了摸索扩增反应的最适温度，以标准菌株（ATCC23715）DNA为模板，分别在60、61、62、63、64和65 ℃条件下，按照试剂盒推荐的体系使用实时浊度仪进行LAMP扩增，80 ℃灭活5 min后，将LAMP产物按1∶4稀释后，取2 μL加上样缓冲液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2  LAMP特异性。

利用建立的LAMP检测方法，在最适温度下，以提取的标准菌株（ATCC23715）及对照菌株的基因组DNA为模板，进行LAMP扩增，80 ℃灭活5 min。将LAMP产物按1∶4稀释后取2 μL加上样缓冲液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时，以ATCC23715为模板，利用LAMP外引物F3、B3进行普通PCR扩增，扩增产物切胶回收后送交生工生物工程（上海））股份有限公司进行测序。测得序列在NCBI网站上进行在线比对，以验证引物的特异性。

1.2.3  LAMP敏感性。

将提取的标准菌株（ATCC23715）的DNA使用核酸蛋白浓度测定仪进行浓度测定，并进行连续10倍倍比稀释，即 1×10-1～1×10-8稀释，对原液和稀释后的DNA按照建立的LAMP方法，在最适温度下进行LMAP扩增，80 ℃灭活5 min。取2 μL LAMP产物加上样缓冲液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4  LAMP临床样品的检测。

利用建立的LAMP方法对临床上采集并提取的208份粪便样品的DNA进行检测。

2  结果与分析

2.1  LAMP反应最适温度的确定

以提取的标准菌株（ATCC23715）DNA为模板，按照试剂盒推荐的25 μL反应体系配制LAMP反应液，并设置阴性对照反应。分别在60、61、62、63、64和65 ℃条件下进行LAMP扩增反应。将LAMP反应产物进行1∶4稀释后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果表明，阴性对照的LAMP反应产物没有可见的DNA条带，而加入DNA模板的6支PCR管中的LAMP反应产物均扩增出“阶梯状”的DNA条带，且反应温度为63 ℃的LAMP扩增产物条带最亮，DNA浓度最大，表明在63 ℃时LAMP反应扩增效率最高，63 ℃是最适反应温度（图1）。

2.2  LAMP反应特异性检测

利用建立的LAMP检测方法，在最适温度63 ℃下以提取的标准菌株（ATCC23715）和其他6种对照菌株的基因组DNA为模板进行LAMP扩增。电泳结果显示，只有标准菌株（ATCC23715）扩增出明显的“阶梯状”的DNA条带，而其他6株对照菌株和阴性对照均无可见DNA条带，表明建立的LAMP方法具有良好的特异性（图2）。同时，因为反应体系中加入了1 μL的FD，在紫外线下可见阳性样品呈现绿色荧光，而阴性对照没有荧光（图3）。用LAMP外引物对标准菌株ATCC23715的DNA进行普通PCR扩增，电泳结果显示获得约240 bp大小的DNA条带（图4），与预期大小一致。PCR产物测序后返回的序列与目的基因进行Blast比对，同源性达100%，因此LAMP和PCR扩增的条带均为目的基因。

2.4  LAMP反应临床样品的检测

利用建立的LAMP检测方法，对来自临床采集的208份放牧牦牛、藏羊粪便样品提取的DNA进行检测，结果共检测出阳性样品26份，阳性率为12.5%（26/208）。

3  討论与结论

耶氏菌是一种能引起人和动物严重的肠道疾病，主要症状有腹泻、胃肠炎、肠系膜淋巴结炎，严重的可引起败血症，在世界范围内造成了严重的经济损失[10]。目前，针对耶氏菌的检测，已经建立了很多方法，主要有免疫学检测和病原培养鉴定等[11-14]。此外，也有将病原培养、免疫和PCR检测相结合，检测食品中耶氏菌的报道[15]。然而，人们普遍认为PCR和Real-time PCR是鉴定耶氏菌的最有效、灵敏、且特异的检测方法[16-17]。

该研究通过对该细菌outL基因的保守序列，在线设计和筛选了一套LAMP引物，并建立了一种用于检测耶氏菌的敏感性、特异性和适用性强的LAMP检测方法。该方法通过LAMP技术检测样本中的DNA，与普通PCR技术相比LAMP方法对仪器和试验条件的要求更低，不需要专门的PCR仪。同时，LAMP方法的扩增效率更高，在1 h内即可做出定性判断。结果判断方法很多，除了可以进行琼脂糖凝胶电泳判定外，也可以根据浊度进行肉眼判断，或者在反应液中加入荧光试剂，在紫外光下判定。后2种方法均不需要对扩增后的反应液进行开盖，避免了DNA对试验环境的污染。与传统的细菌分离、培养鉴定方法相比，LAMP方法操作步骤简便，对操作人员的要求更低，也降低了对环境的污染和操作人员感染的风险。这极大地缩短了检测的总体时间，传统的细菌培养、鉴定至少需要5～6 d，而该方法在30 h内即可做出结果判定，且可以对大量的临床样本进行批量操作。

因此，在该病的检测、预防和控制过程中，建立的该LAMP方法为该病大量样本的流行病学调查及其风险分析提供了一个行之有效的检测工具，应在临床上大量推广使用。

参考文献

[1]HANIFIAN S，KHANI S.Prevalence of virulent Yersinia enterocolitica in bulk raw milk and retail cheese in northern-west of Iran[J].Int J Food Microbiol，2012，155（1/2）：89-92.

[2]AZIZ S N，AZIZ K M.Averting behavior framework for perceived risk of Yersinia enterocolitica infections[J].J Pathog，2012，2012：1-4.

[3]THOERNER P，BIN KINGOMBE C I，BOGLI-STUBER K，et al.PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution[J].Appl Environ Microbiol，2003，69（3）：1810-1816.

[4]TRCEK J，FUCHS T M，TRUELZSCH  K.Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system[J].Microbiology，2010，156（Pt 9）：2734-2745.

[5]ONG K L，GOULD L H，CHEN D L，et al.Changing epidemiology of Yersinia enterocolitica infections：Markedly decreased rates in young black children，Foodborne Diseases Active Surveillance Network（FoodNet），1996-2009[J].Clin Infect Dis，2012，54：385-390.

[6]陸冰洋，刘华栋，李婷婷，等.传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医，2018（15）：135-139，243.

[7]AHMED M E，ELDIGAIL M H，ELAMIN F M，et al.Development and evaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of cystic echinococcosis[J].BMC Vet Res，2016，12：1-10.

[8]张艳艳，叶倩，王正荣，等.基于cox2基因的细粒棘球绦虫环介导等温扩增检测方法的初步建立[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2017，35（2）：169-172.

[9]CAI T，LOU G Q，YANG J，et al.Development and evaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification for hepatitis B virus DNA quantification：A new tool for HBV management[J].J Clin Virol，2008，41（4）：270-276.

[10]BOTTONE E J.Yersinia enterocolitica：Overview and epidemiologic correlates[J].Microbes Infect，1999，1（4）：323-333.

[11]RIBER U，JUNGERSEN G.Cell-mediated immune responses differentiate infections with Brucella suis from Yersinia enterocolitica serotype O：9 in pigs[J].Vet Immunol Immunopathol，2007，116（1/2）：13-25.

[12]BALAKRISHNA K，MURALI H S，BATRA H V.Cloning，expression and characterization of attachment-invasion locus protein（Ail） of Yersinia enterocolitica and its utilization in rapid detection by immunoassays[J].Lett Appl Microbiol，2010，50（2）：131-137.

[13 ]LAUKKANEN R，HAKKINEN M，LUNDN J，et al.Evaluation of isolation methods for pathogenic Yersinia enterocolitica from pig intestinal content[J].J Appl Microbiol，2010，108（3）：956-964.

[14]SAVIN C，LECLERCQ A，CARNIEL E.Evaluation of a single procedure allowing the isolation of enteropathogenic Yersinia along with other bacterial enteropathogens from human stools[J].PLoS One，2012，7（7）：1-8.

[15]ESTRADA C S M，VELAZQUEZ L D C，FAVIER G I，et al.Detection of Yersinia spp.in meat products by eichment culture，immunomagnetic separation and nested PCR[J].Food Microbiol，2012，30（1）：157-163.

[16]LAMBERTZ S T，NILSSON C，HALLANVUO S，et al.Real-time PCR method for detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in food[J].Appl Environ Microbiol，2008，74（19）：6060-6067.

[17]GMEZ-DUARTE O G，BAI J，NEWELL E.Detection of Escherichia coli，Salmonella spp.，Shigella spp.，Yersinia enterocolitica，Vibrio cholerae，and Campylobacter spp.enteropathogens by 3-reaction multiplex polymerase chain reaction[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2009，63（1）：1-9.

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