H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

材料与方法

1.1 试验材料

H9亚型禽流感病毒由笔者所在实验室分离鉴定及序列测定。H5亚型禽流感病毒RNA及阳性血清、H7亚型禽流感病毒RNA及阳性血清均由美国密西西比州立大学万秀峰教授惠赠。鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus，DTMUV），鸡传染性喉气管炎病毒（avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV），鸡传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV），减蛋综合征病毒（egg drop syndrome virus，EDS-76）、H9亚型禽流感病毒阳性血清均由本实验室保存。

1.2 试剂

液体病毒RNA/DNA抽提试剂盒，购自Axygen生物科技有限公司;5×AMV反转录缓冲液、High Pure dNTPs（10 mmol/L）、Rnase Inhibitor（40 U/μL）、反转录酶AMV、dNTPs（2.5 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、Ex Taq反应缓冲液（10×）、Ex Taq酶，均购自TaKaRa公司;反转录随机引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank已发表的H5、H7和H9亚型禽流感病毒基因序列，分析HA基因保守区，应用DNASTAR软件设计3对特异性引物（表1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 样品的准备

按照试剂盒说明书提取H9亚型禽流感病毒、DTMUV、IBV的总RNA。反转录体系：5×AMV反转录缓冲液4.0 μL，反转录随机引物（9 mer）1.0 μL，dNTP（10 mmol/L）2.0 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，AMV反转录酶1.0 μL，模板RNA 11.5 μL。按如下條件将病毒RNA反转录成cDNA：42 ℃ 反应1 h，95 ℃反应5 min。将H5、H7亚型禽流感病毒RNA按上述反应体系和条件反转录成cDNA。参照试剂盒说明书，提取EDS-76、ILTV的DNA，保存于-20 ℃，备用。

1.5 单引物单模板验证

分别以H5、H7、H9亚型禽流感病毒cDNA为模板，进行单引物单模板PCR反应，反应体系如下：总体系为25.00 μL，其中双蒸水15.25 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.00 μL，上、下游引物（50 μmol/L）各0.50 μL，模板cDNA 2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;然后72 ℃延伸10 min。循环反应结束后，将扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重 RT-PCR检测方法的建立

经过对引物比例、引物浓度、Mg2+浓度、反应时间、反应温度等因素的反复优化，确定了H5、H7、H9亚型禽流感病毒多重PCR基本的反应体系为：双蒸水13.25 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.00 μL，H5-P1（50 mmol/L）0.50 μL，H5-P2（50 μmol/L）0.50 μL，H7-P3（50 μmol/L）0.50 μL，H7-P4（50 μmol/L）0.50 μL，H9-P5（50 μmol/L）0.50 μL，H9-P6（50 μmol/L）0.50 μL，混合病原cDNA 2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL。按照“1.5”节中所述PCR程序进行反应，循环结束后将扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 敏感性试验

测定H5、H7、H9亚型禽流感病毒RNA浓度。在此基础上，分别进行10倍梯度稀释，然后反转录成cDNA，进行三重RT-PCR方法检测，确定该方法的敏感性。

1.8 重复性试验

用建立的三重RT-PCR检测方法，对3份禽流感病毒阳性样品重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.9 特异性试验

取DTMUV、ILTV、IBV和EDS-76，分别提取RNA或DNA，采用三重RT-PCR进行扩增，确定本方法检测的特异性。

1.10 三重RT-PCR方法对临床样品的检测

采集江苏地区活禽市场中鸡、鸭、鹅的泄殖腔拭子和喉拭子240份，置于添加四抗的无菌PBS缓冲液中，冻融3次后，尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，弃去24 h内死亡鸡胚，于接种后120 h收集鸡胚尿囊液，分别进行三重RT-PCR检测、血凝试验和血凝抑制试验。

2 结果与分析

2.1 单引物单模板验证

将H5、H7和H9亚型禽流感病毒RNA反转录成cDNA后，采用单引物单模板进行PCR，结果显示，H5、H7、H9亚型禽流感病毒特异性检测引物的目的基因大小分别为427、501、673 bp，与试验设计相符（图1）。

[FK（W9][TPZDM1.tif]

2.2 H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR方法的建立

以H5、H7和H9亚型禽流感病毒混合cDNA为模板，同时采用3对引物进行RT-PCR扩增，经过对引物比例、引物浓度、Mg2+浓度、反应时间、反应温度等因素的反复优化，电泳结果显示，H5、H7和H9亚型混合模板扩增出预期大小的特异性条带（图2）。

2.3 敏感性试验

禽流感病毒核酸初始质量浓度的测定结果为：H5亚型模板的质量浓度为28.0 ng/μL，H7亚型模板的质量浓度为105.3 ng/μL，H9亚型模板的质量浓度为57.3 ng/μL。将其进行101～105稀释后进行三重RT-PCR扩增。检测结果表明，该方法能检测出稀释度为104的H5、H7和H9亚型AIV（图3）。

2.4 重复性试验

用建立的三重RT-PCR检测方法，对3份禽流感样品重复检测3次，结果均出现相同的检测结果，表明所建立的方法具有良好的稳定性和重复性（图4）。

2.5 特异性试验

采用所建立的三重RT-PCR方法对几种禽主要疫病病毒进行检测，结果对坦布苏病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒进行RT-PCR均未出现特异扩增条带，说明该检测方法特异性好（图5）。

2.6 三重RT-PCR方法对临床样品的检测

采集江苏地区活禽市场中鸡、鸭、鹅的泄殖腔拭子和喉拭子240份，接种9～11日龄SPF鸡胚后收集鸡胚尿囊液，利用禽流感三重RT-PCR方法进行检测，结果检测到H5亚型禽流感病毒5份、H9亚型禽流感病毒6份，H9和H7亚型混合感染1份。所检测结果与血凝试验和血凝抑制试验的结果完全符合，证明该方法可用于临床检测（图6）。

3 结论与讨论

禽流感病毒可引起禽类全身性或呼吸器官性传染病。至今A型禽流感病毒的血凝素已发现16种，神经氨酸酶10种，其血清型较多，易变异[11]。病毒主要通过病禽的排泄物、分泌物和尸体等污染饮水和饲料，经消化道或伤口传染[12]。早期快速诊断和血清学监测是预防、控制禽流感的前提条件。由于感染禽种类、年龄、性别、所处环境以及感染并发症的不同，表现的临床症状差异极大，因此，该病主要依靠实验室诊断。

目前，禽流感的诊断技术主要有病毒分离鉴定、免疫荧光、RT-PCR、血凝抑制、琼脂扩散、ELISA等，其中病毒分离鉴定和RT-PCR具有很高的敏感性和特异性[13]。但由于病毒分离鉴定操作繁琐、耗时较长，因此，RT-PCR技术仍然是当前诊断禽流感的主要方法。多重PCR是在以单基因PCR为基础上进行的发展和完善，是在同一PCR体系中加入多对特异性引物，一次同时扩增多个靶基因，实现了多基因型的鉴别和多种病原体的同时检出，使混合感染的诊断和基因分型变得更加简捷，减少了漏诊率，提高了检验效率。张文慧等建立了同时检测H5和H7亚型禽流感病毒的多重RT-PCR方法[14];陈思怀等针对NP（型诊断）、HA（亚型诊断）基因设計2对引物，从而对H5、H6、H9亚型AIV做快速检测[15]。马鸣潇等针对H5和H9这2个亚型，各设计1套特异性的引物，建立了RT-PCR一步法，用于H5和H9亚型的鉴别[16]。

本研究针对我国养禽业的主要病毒亚型H5、H7和H9，设计3对特异性检测引物，通过条件优化，建立了同时检测H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR方法。该方法可同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒，检测灵敏度分别达 2.80、10.50、5.73 pg/μL，方法特异性好、重复性高，可用于快速诊断禽流感，进行禽流感早期预测。本方法的建立可为禽流感防治提供有效的早期诊断技术和监测手段，同时也为高致病性禽流感防治争取了宝贵的快速反应时间。

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