蒙药手参药材与奶手参的质量标准

摘要 目的：对蒙药手参药材和奶手参（奶制饮片）进行系统性生药学鉴定及分析，为其质量标准的建立及鉴定提供科学依据。方法：参照《中华人民共和国药典》（2010年版附录）相关方法，对手参药材和奶手参的水分，灰分及浸出物进行测定；采用显微，薄层色谱法进行定性鉴别。以天麻素为对照品，用70%甲醇提取，以乙酸乙酯-甲酸-水（9∶1∶0.2）为展开剂，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法对手参与奶手参中的多糖及天麻素进行含量分析。色谱柱为ZOBB AX eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 cm）柱；以甲醇-0.04%的磷酸溶液（8∶92）为流动相，流速为1.0 mL/min；检测波长222 nm；柱温30 ℃。结果：薄层色谱法试验中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。高效液相色谱条件下天麻素被洗脱且达到基线分离，天麻素在浓度0.009～0.09 mg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=586866X+425821（R=0.9996），平均回收率为100.1%。精密度试验、重复性试验、稳定性试验均符合要求。三批样品浸出物结果为26.13%～42.58%，水分为3.47%～5.31%，总灰分为5.43%～6.33%。结论：质控方法可靠，灵敏度高，专属性，准确，稳定性好。该结果对手参药材鉴定、资源利用及质量标准提升，提供科学依据。

关键词 蒙药；手参；顯微鉴别；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

Abstract Objective：To carry out a systematic pharmacognostical study on Shoushen and Naishoushen， and to provide the basis for establishing its quality standard and appraisal. Methods：Based on the methods recorded in appendix of Pharmacopoeia of the People′s Republic of China （2010 edition， volume1）， the water content， total ash and ethanol-soluble extractives of the crude drugs were detected. The microscopy TLC was used for qualitative identification. With gastrodin as control agent， 70% methyl alcohol was used to extract. With ethyl acetate formic acid-water （9∶1∶0.2） as developing solvent， 10% phosphomolybdic acid ethanol solution was sprayed. And at 105 ℃ heated until spot color was clear. By ultraviolet-visible spectrophotometry and HPLC method were used for the determination of contents of the polysaccharides and gastrodine of Shoushen and Naishoushen. Chromatographic column for ZOBB AX eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 cm）； methanol-water （0.04% phosphoric acid） （8∶92） was used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was at 222 nm. Results：In thin layer chromatography （TLC）， the same color spots were detected in the corresponding positions of the chromatography. HPLC was used to elute the gastrodine and achieve the baseline separation. The concentration of gastrodine in the concentration range 0.009～0.09 mg/mL was good. And the regression equation was Y=586866X+425821 （R=0.9996） and the average recovery was 100.1%. Precision test， repeatability test， stability test were in line with the requirements. Three batches of sample extract was 26.13%～42.58%， water 3.47%～5.31% and total ash content was 5.43%～6.33%. Conclusion：The indictment method is reliable， sensitive， specific， accurate and stable. The results provide scientific basis for identification， resource utilization and improvement of quality standards.

Key Words Mongolian medicine； Shoushen； Microscopic identification； TLC； HPLC； Quality standard

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.054

手参为兰科多年生草本植物手掌参Cymnadenia conopsea P.Br.的块茎，因药用部分类似手掌而故名。异名为“旺拉嘎”，春秋季采挖，晒干。其味甘、涩，性温。有滋养体素，壮阳，固精等多个功效[1-3]。主要分布于我国东北、华北、西北、四川[3]。手参作为蒙医传统药材，在多数滋补，壮阳，延年益寿处方中不可缺乏。《蒙药正典》中记载[4]：“手参分为两大类，即手掌参和盘龙参。手掌参根有五指者佳，指越少质越次。盘龙参根如手指并握状，也有分一二手指的。功效比手掌参差”。手参块茎中含化学成分较多，已分离鉴定的有氨基酸类，其中苏氨酸含量最高[6]，苷类、脂类[7]、二氢类[8]等。手参作为蒙医常用药材具有较高的临床应用价值。与五灵脂、石榴、黄精、黑冰片等37种药材制成手参三十七味丸，具有治肾寒、生津壮阳、滋补等功效[9]。与熊胆、冬虫夏草、黄精等滋补强壮药配伍制成六味手参散，可治疗滑精，阳痿等症[10]。与苦参等制成手参三味汤，用于治游痛症，陶赖病[11]。

1 仪器与试药

显微镜（光学显微镜，×400）；高效液相色谱仪（岛津LC-204）；KQ-250DE型超聲清洗器；UV230+型紫外分光光度仪（大连伊力特牌）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；天麻素（批号：151130），三批手参药材经内蒙古药检所鉴定为正品。甲醇（色谱纯），水（超纯水，蒸馏水），所用其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别试验

茎块稍扁，形如手掌，长1～4.5 cm，直径1～3 cm，表面浅黄色或暗棕色，有细皱纹，顶端有茎残基，其周围有点状根痕；下部有4～14指状分枝，分枝长0.3～2.5 cm，直径2～8 mm。质坚硬，不易折断，断面黄白色，角质样。气微，味淡，嚼之发黏；奶手参表面黄色或暗褐色。略具奶香气，味淡。见图1。

2.2 显微鉴别

手参与奶手参粉末呈浅黄色，淀粉粒多见，不规则粘液质团块众多，加碘液试液呈紫蓝色。草酸钙针晶易见，在薄壁细胞中成束散在，长8～65 μm。导管多梯纹、网纹，螺纹少见，直径13～55 μm，薄壁细胞多，有的甚大。见图2。

2.3 薄层色谱鉴别

供试品的制备 取1.0 g手参或奶手参粉末，加入70%甲醇5 mL，超声处理30 min后过滤。将滤液蒸干，残渣加入70%甲醇1 mL使完全溶解。

对照品溶液的配置 取天麻素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。

参照《中华人民共和国药典》2010版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述2种溶液点于同一个硅胶G薄层板上，展开剂为以乙酸乙酯-甲酸-水（9∶1∶0.2）。展开，取出，晾干后喷以10%磷钼酸乙醇溶液进行显色，于105 ℃加热至斑点显色清晰。手参与奶手参药材在与对照品色谱相应位置，显相同斑点。见图3。

2.4 水分与总灰分

按照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅸ H烘干法和附录Ⅸ K总灰分测定法试验测定水分和总灰分，结果见表1。

2.5 浸出物

根据手参化学成分，并结合生产实际，按照《中华人民共和国药典》2010年版第一部附录ⅩA的方法，以水为溶剂，冷浸法测定手参的浸出物含量，测定结果见表2。

2.6 总糖、多糖和天麻素含量测定

2.6.1 总糖 照2010版《中华人民共和国药典》紫外-可见分光光度法进行测定。

对照品溶液的制备：精密称取烘干至恒的无水葡萄糖适量，加水制成每l mL含1.0 mg的溶液。

标准曲线的绘制：精密量取葡萄糖溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于50 mL容量瓶，补蒸馏水至刻度。分别取上述溶液2 mL，置试管中并加入15%苯酚溶液1 mL，摇匀后加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，在40 ℃水浴锅中放置30 min。以相应试剂为空白，于490 nm处检测吸光度，以浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线。

测定法：取约0.5 g手参或奶手参粉末（过六号筛），置圆底烧瓶中并加入50 mL水，加热回流1 h，再称定质量，用水补足减失的质量。过滤，取1 mL滤液置100 mL量瓶中并加水至刻度。精密量取25 mL于50 mL量瓶中，并补水至刻度。精密量取上述溶液2 mL于试管中，按照标准曲线制备项下的方法，加入1 mL苯酚溶液（15%），摇匀后迅速加入5.0 mL硫酸后在40 ℃水浴锅中放置30 min。于490 nm处检测吸光度值。

测定结果：3批手参药材为17.5%～20.4%，均值为19.0；3批奶手参为17.9%～21.4%，均值为19.2%。

2.6.2 多糖

本品多糖含量通过测定样品中还原糖含量，再通过总糖含量减去还原糖含量计算得到。

对照品溶液的制备：同上2.6.1相应方法制备。

绘制标准曲线：吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mL于试管中并加蒸馏水使成3 mL，加DNS试液2 mL，置沸水浴中加热8 min。取出冷却后至室温，置10 mL容量瓶定容。按照紫外-可见分光光度法，在494 nm处检测吸光度，以浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

还原糖的测定法：取约0.5 g手参或奶手参粉末（过六号筛），置圆底烧瓶中加入10倍数的水，摇匀，加热回流1 h。放置冷却后称定质量，用蒸馏水补足减失的质量。过滤，取滤液2.5 mL，于试管中，加水使成3 mL，加入DNS试液2 mL，置沸水浴中加热8 min。取出后迅速冷却至室温用水定容至刻度。在494 nm处检测吸光度值。多糖含量=总糖含量-还原糖含量。

测定结果：3批手参药材为14.2%～18.4%，均值为16.5%；3批奶手参为13.9%～17.4%，均值为15.65%。

2.6.3 天麻素

2.6.3.1 色谱条件与系统适用性条件

色谱柱为ZOBB AX eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 cm）柱；以甲醇-0.04%的磷酸溶液（8∶92）为流动相，流速为1.0 mL/min；检测波长222 nm；柱温30 ℃，进样量为20 μL。

2.6.3.2 对照品溶液的制备 精密称取天麻素对照品3.5 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

2.6.3.3 供试品溶液的制备 取1.5 g手参粉末，置圆底烧瓶中并加入15 mL水，加热回流2 h，过滤，合并滤液。浓缩后置25 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，滤过，取滤液，即得。

2.6.3.4 线性关系考察

精密量取天麻素对照品溶液1、3、5、7、10 mL置10 mL容量瓶，用甲醇定容。从中各取20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=586 866X+425 821，R=0.999 6。结果表明天麻素对照品在浓度0.009～0.09 mg/mL范围内线性关系良好，结果见图5。

2.6.3.5 精密度試验

精密吸取2.6.3.2项下对照品溶液液20 μL，按照2.6.3.1项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，计算其RSD为0.6%，表明仪器精密度良好[12]。

2.6.3.6 稳定性试验

精密吸取2.6.3.3项下的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h进样20 μL，记录6次的峰面积，计算其RSD为1.5%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.6.3.7 重复性试验

取同一批手参样品，按2.6.3.3项下方法制备6份供试品溶液，按照2.6.3.1项下色谱条件，连续测定6次，记录峰面积，计算其RSD1.3%，表明该方法重复性良好。

2.6.3.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的手参样品6份，每份0.75 mg。分别加入天麻素对照品适量，按照2.6.3.3项下方法制备6份供试品溶液。平均回收率为100.1%，RSD为0.85%。

2.6.3.9 样品含量测定

称取1.5 g手参药材样品3份，按照2.6.3.1项下色谱条件下进行测定，按外标法以峰面积计算，平均含量2.22 mg/g。见表3。

3 讨论

根据前期文献报道，目前手参的含量测定研究一般多以多糖[13]和盐酸小檗碱[14]作为指标，但小檗碱的主要药理作用为杀菌，不符合手参蒙医认为的功能；多糖虽有免疫调节之作用，但是不稳定，定量难度较大。本研究认为作为蒙药手参的含量测定，一方面要体现手参的功能，另一方面具备较为稳定的理化性质，且具专属性。手参含天麻素量虽少，尤其在奶制手参饮片中含量不稳定（经探讨，与药材新鲜程度有关，可通过改善储藏来解决）。天麻素具有抗惊厥、镇痛、增加心脑血流量、抗衰老、改善学习记忆力等药理作用[15]。故选用天麻素作为手参药材含量指标，采用高效液相色谱法测定，很有现实意义。该方法简便，专属性强，高效，因此可建立可控的质量标准，为其开发利用提供依据。

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