离子交换层析法测量糖化血红蛋白的不确定度评定及应用

[摘要] 目的 評定离子交换层析法测量糖化血红蛋白（HbA1c）不确定度，以此为例探讨不确定度在临床诊疗上的应用价值。 方法 从分析前、分析中、生理变异及其他疾病影响因素等各个环节梳理离子交换层析法测量HbA1c的不确定度来源，合成、计算其标准不确定度及扩展不确定度；举例探讨HbA1c不确定度在临床诊疗上的应用。 结果 分析中的不精密度、系统误差、校准品不确定度、校准品复溶产生的误差、为HbA1c测量不确定度的主要来源，而分析前因素可通过分析前质量控制加以控制，生理变异及其他疾病影响因素仅针对个别群体，不具有普遍性因此均可以不予考虑。5.11及10.04两个室内质控水平的相对标准不确定度分别为6.33%、4.54%，标准不确定度分别为0.32%、0.46%，扩展不确定度分别为0.64%、0.92%。在5.11%和10.04%附近水平的同一患者前后两次测量结果差值分别大于0.45%、0.41%，结果才具有显著性意义。考虑到测量不确定度，HbA1c<5.86%，可排除患糖尿病的可能，HbA1c>7.14%可确诊糖尿病，HbA1c值位于5.86%及7.14%之间，不能确定是否患有糖尿病，需进一步检查确诊。 结论 测量的不精密度、系统误差、校准品赋值的不确定度、校准品复溶产生的误差是离子交换层析法测量HbA1c的不确定度主要来源，不确定度在疾病的诊断、疗效评估方面有重要意义。

[关键词] 糖化血红蛋白；离子交换层析法；不确定度；评定与应用

[中图分类号] R576.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（a）-0131-04

[Abstract] Objective To evaluate the uncertainty of glycosylated hemoglobin （HbA1c） measuredby ion-exchange chromatography， and todiscussthe application value of uncertainty in clinical diagnosis and treatment. Methods The source of uncertainty were combed from pre-analysis， analytical phase， physiological variation， some diseases influence factors， and so on. Then the standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated and the clinical applications of uncertainty in clinical diagnosis and treatmentwere illustrated. Results The main source of the uncertainty on HbA1c measured by ion exchange chromatography were imprecision， systematic error， the uncertainty of calibration product and errors caused by calibration product redissolved during measurement. The pre-analysis factors could be controlled by pre-analysis quality control. Physiological variation and other disease affecting factors wereonly related to some individuals without universality， which could not taken into consideration. The relative standard uncertainties of the internal quality control concentrationsin 5.11% and 10.04% were 6.33% and 4.54% respectively， the standard uncertainties were 0.32% and 0.46% respectively and the expanded uncertainty were 0.64% and 0.92% respectively. Two HbA1c measurements near by 5.11%， 10.04% for respectively. Taking the uncertainty into consideration， the possibility of suffering from diabetes could be excluded when HbA1c concentration of patient <5.86%， in addition diabetes could be diagnosed when HbA1c>7.14%. While patientscould not be determined whether suffering from diabetes when HbA1c value is located between 5.86% and 7.14%， which needed further examination to confirm. Conclusion The main source of the uncertainty on HbA1c measurement by ion exchange chromatography are measurement imprecision， systematic error， the uncertainty of calibrator productand the errors caused by calibrator product redissolving. The uncertainty is significant to diagnose clinical diseases and evaluate curative effect.

[Key words] Glycosylated hemoglobin； Ion exchange chromatography； Uncertainty； Evaluation and application value

目前，全世界糖尿病患者为2亿人，我国糖尿病也达到了4千万人，随着生活水平的提高，工作节奏的加强及运动逐渐减少，糖尿病患病率还在不断上升。糖尿病已成为世界上仅次于心血管、癌症的第三大死亡原因。糖尿病患者多死于并发症，因此监控糖尿病患者血糖水平对于预防或减缓并发症的发生至关重要。而糖化血红蛋白（HbA1c）是血红蛋白糖基化不可逆反应，反映的是2～3个月的血糖平均水平，其检测亦不受是否空腹的影响[1]。目前，已被国际临床化学和实验室医学联盟（IFCC）作为诊断糖尿病、监控血糖水平、評价糖尿病疗效的重要指标[2-4]。因此，HbA1c测量结果的准确性直接影响到糖尿病的诊断与治疗。误差是测量值与被测量物真值的差值，分为随机误差及系统误差，但真值无法知道，因此误差也不会精确计算[5]。近年来，计量学引入不确定度。通俗来说，不确定度与测量值一起表征测量真值在一定包含概率，位于一定的包含区间，其大小代表测量结果的可疑程度[6]。离子交换层析法作为IFCC推荐的测量HbA1c的金标准方法，目前已广泛应用于临床，但国内外鲜有关于其不确定度的评定以及不确定度在临床上应用的报道，因此对此进行探讨、研究对糖尿病的诊疗具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器为日本TOSOH公司C723-G8。室内质控物及校准品均为日本东曹（上海）公司提供。室内质控品分为5.11%、10.04%两个水平，校准品分为5.97%、10.99%两种水平。

1.2 不确定度评估方法

1.2.1 采用分析离子交换层析法测量HbA1c不确定度的来源

分析前、分析中都会给测量带来不确定度。分析前引入不确定度的环节包括标本保存条件、运送时间以及患者的准备情况等，但很难进行评估，可通过分析前质量控制来降低。分析中的测量的重复性、校准品的赋值、校准品复溶以及测量系统偏倚也都会引入不确定度，此外患者生理变异或并发其他疾病等影响因素也会引入不确定度，但其仅针对个体或某个人群，不具备普遍性[7]。因此，本研究从测量重复性、校准品复溶、校准品赋值以及测量偏倚这几个方面评定离子交换层析法测量HbA1c的不确定度[8-9]。

1.2.2 不确定度评定

1.2.2.1 A类不确定的评定 A类不确定度是从一系列观测值统计分析评价的不确定度分量[10]，分析中不精密度引入的不确定度属于A类不确定度。采用对两个水平的室内质控品分别在1 d内测量一批，一批测量20次，统计所得的CV%作为批内不精密度。我室室内质控每月的CV%值可作为日间不精密度。

1.2.2.2 B类不确定的评定 B类不确定度是用不同于观测值进行统计分析的方法来评定不确定度分量[10]，与室内质控品浓度相近的卫生部室间质评两个水平（5.11%、10.04%）的偏倚、校准品的不确定度以及校准品复溶产生误差都是B类不确定的评定来源。

1.2.3 不确定度计算公式

标准不确定度=-相应浓度水平×相对标准不确定度，扩展标准不确定度=K标准不确定度，K常取2。

1.3 不确定度的临床应用[11]

1.3.1 判断同一患者前后测量结果的差异性，拟评估疗效或判断测量结果的准确性

仅同一患者前后两次测量值差值≥uΔ，2次结果差异才有显著性意义，证明临床疗效显著或其中一次的测量结果不准确。

1.3.2 帮助确诊医学决定水平附近测量值的患者是否患有某种疾病

测量结果及其扩展相对不确定度差值高于糖尿病的医学决定水平可考虑诊断为糖尿病，低于则可基本排除糖尿病。

2 结果

2.1 A类不确定度评定

2.1.1 不精密度引入的不确定度

两个室内质控水平的批内及日间不精密度见表1。

2.1.2 校准品复溶吸量产生的误差引入的不确定度

校准品复溶采用5 mL液管吸取4 mL蒸馏水进行复溶，根据《中华人民共和国国家计量检定规程》（JJG646-2006）[12]，校准品复溶的最大允许误差为2.5%。

2.2 B类不确定度分量评定

校准品不确定度分量来源于东曹公司的校准品溯源性报告。见表2。

2.3 系统偏倚评定

获取2016、2017年实验室参加卫生部室间质评回报数据，根据《临床检验方法评价》[13]公式计算实验室系统偏倚。见表3。

2.4 合成不确定度按照公式计算

当HbA1c=5.11%时，相对标准不确定度为0.932+2.52+5.552+1.402=6.33%，标准不确定度为5.11%×6.33%=0.32%，取k=2，扩展不确定度=0.32%×2=0.64%；同理计算，当HbA1c=10.04%时，相对标准不确定度为4.54%，标准不确定度=10.04%×4.54%=0.46%，扩展不确定度=0.46%×2=0.92%。

2.5 不确定度临床应用

2.5.1 判断同一患者最近两次测量结果是否差异显著方面的应用

5.11%附近的测量值的uΔ=+0.32%2=0.65%，故仅两次结果差值大于0.65%，差异存在显著性意义。以此计算，只有10.04%附近的两次测量值差值大于0.41%，差异有显著性意义。其他测量值以此类推。

2.5.2 根据HbA1c测量值诊断糖尿病方面的应用

2010年美国糖尿病协会推荐6.5%作为HbA1c诊断糖尿病的医学决定水平[14]。在本实验系统中，HbA1c测量值<5.86%（医学决定水平扩展不确定度=6.5%），可考虑排除糖尿病，>7.14%（6.5%）结合临床症状可考虑诊断糖尿病，在5.86%～7.14%间，尚不能诊断或排除糖尿病，需进一步做糖耐量检测。例如某患者空腹血糖测量值为6.61%，略高于HbA1c医学决定水平6.5%[14]，如不考虑不确定度，可能会误诊为糖尿病，但考虑到测量不确定度，其测量真值在95%的包含概率分布在5.97%～7.25%范围间（标准不确定度为0.09%），因此该患者HbA1c测量真值有可能低于美国糖尿病协会推荐的诊断糖尿病医学决定水平（6.5%），亦有可能高于医学决定水平，此时尚不能确诊该患者为糖尿病，需进一步做糖耐量实验结合临床症状确诊。

3 讨论

分析前、分析中每一个环节都可以导致测量误差，引入不确定度，此外受试对象的生理变异及其他一些影响测量准确性的疾病也可引入不确定度，据报道，尿毒症、血红蛋白变异体，HbA1c氨甲酰化（尿毒症）及乙酰化，HbA1c代谢周期异常以及HbA1c前体都会影响离子交换层析法测量HbA1c正确度[15-16]。但这些疾病因素仅针对某种单一群体，不具有普遍性，因此本研究在不确定度评估时可不予考虑。

影响测量准确性的分析前因素常包括被测量者状态，标本采集、运送条件、运送时间、保存条件及时间等，因HbA1c代表的是患者2～3个月的血糖平均水平，其检测不受采集时患者是否空腹、是否使用胰岛素或服用降糖药物等因素的影响，因此患者采集时状态对测量结果不会产生影响，可不予考虑。此外，对于上述分析前因素引入的不确定度可通过制定标本采集手册，对护理及运送护工进行严格的培训，制定不合格标本标准并严格执行，定期反馈不合格标本率，持续改进标本合格率等一系列措施，将因采集、保存、运输等分析前因素引入的不确定度控制在≤1/5最大不确定度分量范围内，可忽略[13]。纵观分析中全过程，存在校准品复溶、校准、吸样、测量等过程，校准品复溶时吸取蒸馏水的准确性、校准品赋值的准确度以及校准品复溶后吸量误差也都直接影响测量结果的准确性，因此这些因素也应纳入不确定度评定来源，而校准品赋值的准确度以校准品不确定度体现出来。分析中的其他不确定分量诸如吸样是否精准、层析柱的洗脱等因素最终是以不精密度及不正确度的方式表现出来。因此分析中的不确定度评定主要应从校准品不确定度、分析中不精密度、分析结果不正确度3个大的方面进行评估。此次评定中把批内及日间不精密度作为A类不确定度来源，日间不精密度数据来源于我们实验室室内质控数据；室间质评结果偏倚体现的是检测系统的不正确度，因此引用我室参加卫生部室间质评的偏倚作为B类不确定度分量进行评定，校准品不确定度来源于校准品生产厂家资料，因此，亦应作为B类不确定度进行评定。

由于参考范围和医学决定水平不存在不确定度，而测量结果存在不确定度，因此在诊断疾病时，不考虑测量值的不确定度，把测量结果直接与参考范围或医学决定水平进行比较，来确诊某种疾病，有一定误诊的风险。测量结果与不确定度一起表达表征实验真值的分布范围，因此科学的比较方法应考虑测量结果的不确定度。在本研究HbA1c测量值不确定度的应用示例中可知如不考虑不确定度，就会导致医生的误诊。此外，临床医师经常会比较同一患者最近两次测量结果，却难以判断两个测量值差异的显著性，也无法推断两次测量结果的准确性，特别是在治疗过程中难以通过两次测量结果来评价疗效，但引入不确定度后，此问题就很容易地解決了。因此，不确定度的引入对检验科加强与临床沟通，帮助临床医生诊断疾病、评估疗效及患者病情变化有重要意义。

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