南海具抑菌活性微生物的筛选与鉴定

摘要：在南海深海海泥中采用平板法分离具有抑菌活性的微生物，以纸片法研究其抗菌活性，对分离到的活性细菌进行16S rRNA测序并构建系统进化树，对细菌进行生长特性研究。结果表明，从海泥中分离到9株具有抑菌活性的微生物，分别属于Bacillus和Salinicola属。菌株j65可在含盐率20%的条件下生长，除菌株gu8外其他菌株均可在pH 6～10的环境下生长。

关键词：海洋微生物；分离鉴定；抑菌试验；系统进化树

中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）10-0065-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.015

Isolation and Identification of Antibacterial Bacteria in South China Sea

TIAN Liang-yu1，PENG Shu-ya1，GU Hui-hui2，JIANG Chao2，ZHU Dao-chen2，ZHOU Xiao-jian1

（1.College of Environmental Science & Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；

2.College of Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 222013，Jiangsu，China）

Abstract： The bacteria which had antibacterial activity was isolated from the sediments of South China Sea by plate isolation.The antibacterial activity of isolates were identified by paper disk method. The active isolates were identified by 16S rRNA sequencing and the phylogenetic tree constructed by neighbour-joining method. The growth characteristics of bacteria were studied. The results showed that nine active antibacterial bacteria belonging to genus Bacillus and Salinicola were isolated from sediment samples. It was indicated that strain j65 could grow at the concentration of 20% NaCl，and all strains could grow at the range of pH 6～10，except for strain gu8.

Key words： marine microorganism； isolation and identification； antibacterial experiment； phylogenetic tree

海洋獨特的高压、高盐、高温、严寒、无光照等环境特点，造就了海洋微生物物种的独特性与多样性[1]。微生物在这样的特殊环境中，演化出了特殊的代谢途径，能够产生许多结构新颖和功能奇特的代谢产物[2，3]。近年来，人们从陆地微生物菌种资源中寻找新的活性物质和新药已变得越来越困难[3]，抗药性问题也日益严重[4]。因此，对海洋微生物的研究越来越受到世界各国和组织的重视[4，5]，对从海洋微生物中获取新的特效活性物质和新药寄予了极大的希望[2，5，6]。目前，有研究者从海洋动物和海洋植物体表或者体内分离筛选得到具有抑菌活性的海洋微生物[1，7]，而直接从海洋深处的海泥中分离、筛选与鉴定具有抑菌活性微生物的研究则鲜有报道[6，7]。

随着人们对畜产品安全和环保意识的不断加强，益生菌作为抗生素的替代品受到广泛的关注，并逐渐应用于养殖动物的营养和饲料添加中。有研究指出，益生菌作为抗生素的最佳替代品之一，具有增强宿主抵抗力、提高集体健康水平、减少疾病发生等优点[8]。作为新型的饲料添加剂，益生菌已被广泛应用于水产、畜禽养殖产业中。本研究拟从南海海泥中筛选抑菌海洋微生物，对其进行鉴定和构建系统进化树，并研究其生理特性，是新药开发的一项重要的前期工作[9]；同时，也可为畜禽饲料益生菌提供新的来源，为南海海洋微生物资源进一步开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 采用南海海洋深处的海泥。

1.1.2 分离纯化培养基 M1培养基：淀粉10 g，酵母粉4 g，蛋白胨2 g，纯化琼脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌25 min[10]。

2216E培养基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，维生素1 mL（过滤灭菌），磷酸高铁0.1 g，纯化琼脂18 g，海水定容至1 000 mL。pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min。

高氏1号培养基：硝酸钾1 g，磷酸氢二钾0.5 g， 七水合硫酸镁0.5 g，七水合硫酸铁 0.5 g，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min。

ISP3培养基：燕麦粉20 g，微量元素溶液W 1 mL，纯化琼脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min。

ISP4培养基：淀粉10 g，磷酸氢二钾1 g，七水合硫酸镁1 g，硫化氨2 g，碳酸钙2 g，七水合硫酸铁0.001 g，氯化锰0.001 g，纯化琼脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min[11]。

ISP5培养基：L-天门冬酰胺1 g（过滤灭菌），甘油10 g，磷酸氢二钾1 g，微量元素溶液W 1 mL，纯化琼脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min。

改良罗氏培养基：谷氨酸钠7.2 g，柠檬酸钠0.6 g，磷酸氢二钾2.4 g，硫酸镁0.1 g，孔雀绿0.4 g，丙三醇12 mL，鸡卵液1 000 mL，海水定容至600 mL，90 ℃灭菌1.5 min。

無机盐琼脂培养基：淀粉20 g，磷酸氢二钾0.5 g，七水合硫酸镁0.5 g，硝酸钾1 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，纯化琼脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min。

琼脂培养基：纯化琼脂8 g，海水1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃灭菌20 min。

以上培养基用500 mL烧杯分装，每瓶装200 mL，过滤或高温灭菌。培养基中海水均为人工海水，微量元素溶液W为Wolfe Trace[12]。人工海水组成：NaCl 20 g/L，MgSO4·7H2O 6 g/L，MgCl2·6H2O 3 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，NaHCO3 0.2 g/L，NaBr 0.05 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，KH2PO4 0.42 g/L，SrCl·6H2O 0.02 g/L，Fe（NH4）citrate 0.01g/L，KCl 0.5 g/L。维生素组分配方：烟酸10 mg/L，生物素4 mg/L，泛酸10 mg/L，硫辛酸10 mg/L，叶酸10 mg/L，维生素B1 10 mg/L，维生素B2 10 mg/L，维生素B6 10 mg/L，维生素B12 10 mg/L，对氨基苯甲酸10 mg/L。Wolfe Trace组分配方：Nitrilotracetic acid 1.5 g/L， MgSO4·7H2O 3.0 g/L，MnSO4·2H2O 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CoCl2 0.1 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L， ZnSO4 0.1 g/L， CuSO4·5H2O 0.01 g/L， AlK（SO4）2 0.01 g/L，H3BO3 0.1 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L。

1.1.3 主要试剂与仪器 Taq酶、dNTP等均购自宝生物工程（大连）有限公司，16S rDNA引物购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他试剂均为分析纯，购自国药集团。凝胶成像仪、电泳仪、PCR扩增仪购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分离纯化、培养、保藏 海泥处理：用无菌药勺秤取1 g于10 mL无菌生理盐水中，用涡旋器激烈振荡制成均匀的浑浊液，最后稀释成10-2 g/mL。将处理后的海泥样品用涂布法在琼脂培养基上进行涂布[13]。分别吸取50 μL稀释液在上述每种培养基上进行涂布，每种样品2～3个重复，在37 ℃培养箱中培养。1 d后观察平板中菌落生长状况，避免菌苔生成影响分离取样。2～4 d后观察平板，根据菌落的不同颜色、不同形态进行划线分离，采用区域划线法，继续37 ℃培养，挑取单个菌落，继续重复划线，纯化2～3次，得到纯菌株。挑取单个菌落于试管培养液中进行培养，于37 ℃摇床中培养1～2 d，在无菌台上吸取200 μL菌液以及200 μL 30%的甘油1∶1进行保存。存放于-80 ℃冰箱。

1.2.2 抑菌试验 采用纸片法进行抑菌试验[14-16]。选用国标滤纸，剪成6 mm直径的滤纸片，121 ℃灭菌20 min后烘干。分别在不同琼脂培养基上加入稀释适当浓度的指示菌悬液200 μL，涂抹均匀。在纸片上加入50 μL待测菌株的去细胞培养液，以无菌培养基作空白对照，待自然干燥后轻放在涂有指示菌的培养皿中，37 ℃培养1 d。

指示菌液的配制：分别取经过37 ℃培养24 h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养物与生理盐水1∶9稀释，且用涡旋器振荡使菌体均匀分散。

操作步骤：稀释指示菌液，涂布平板；加入载有相应测试菌液的滤纸片；37 ℃培养1 d，观察指示菌生长情况。

1.2.3 分子生物学鉴定 制备模板：将分离纯化的菌株进行活化培养1 d，提取细菌基因组DNA[17]。

PCR扩增反应体系：TaKaRa Tag（5 μg/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer（Mg2+ Free）5 μL， MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，模板DNA 2 μL，引物1（20 μmol/L）1 μL，引物2（20 μmol/L）1 μL，灭菌去离子水定容至50 μL[17]。

PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。以1%琼脂糖凝胶检测16S rRNA的PCR扩增结果[18]。

1.2.4 构建系统进化树 将PCR扩增的16S rDNA产物进行凝胶纯化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。用多重序列比对软件ClustalW2进行新型分离菌株16S rRNA序列与具有抑菌活性细菌的16S rRNA序列比对，用分子进化遗传分析软件MEGA 5.0进行序列同源性分析，采用邻接法（Neighbour-Joining）构建系统发育树[19]。

1.2.5 盐及pH耐受性试验 测试含盐率设置为5%、8%、10%、13%、15%、20%，测试pH设置为6、9、10、11，根据活性微生物的生长情况确定盐及pH耐受性。

2 结果与分析

2.1 抑菌微生物的分离筛选

对海泥样品进行平板涂布分离，通过观察菌落形态特征，挑选单菌落。经纯化，并结合后期的抑菌活性试验，共得到9株活性菌株。将获得的16S rRNA基因序列，提交到NCBI数据库进行BLAST同源性比对[19，20]。发现所获得9株活性菌株分别属于9种不同基因表型，除j65外，其余8株均属于Bacillus（表1）。

2.2 抑菌作用

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌，9株菌株的抑菌活性见表2。由表2可知，菌株E205b、gu8、gu6、j65对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定抑制作用。菌株gu16、gu22、j24、j57对大肠杆菌有明显抑制作用，而菌株gu2对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。其中gu6、j65对两种指示菌均有明显抑制作用，活性最优。

2.3 系统发育树的建立

将菌株gu6序列在NCBI中进行BLAST比对，比对结果显示其16S rRNA基因序列与Bacillus vietnamensis、B. aquimaris的同源性最高，同源性分别为96.90%、95.67%。在比对结果中选取同源性较高菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0软件进行序列比对，并用邻接法构建系统发育树[21，22]，从系统发育树（图1）可以看出，菌株gu6与B. aquimaris同在一个进化分支上，可以认定gu6属于芽孢杆菌属。

将菌株j65序列在NCBI中进行BLAST比对，比对结果显示其16S rRNA基因序列与Salinicola salarius同源性最高，同源性达98.73%。在比对结果中选取同源性较高菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0软件进行序列比对，并用邻接法构建系统发育树[21，22]，从系统发育树（图2）可以看出，菌株j65与S. acroporae同在一个进化分支上，可以认定j65属于栖盐田菌属。

鉴于筛选的两株细菌同源性、生理生化特征和已知菌种存在一定差异，表明菌株gu6和j65可能是潜在的新种，还需根据这两株菌株的细胞化学组成和基因组DNA-DNA杂交结果来确定[13]。

2.4 抑菌微生物的盐、pH耐受性

由表3可知，当含盐率在15%及以下时，除j24在含盐率15%时不能生长外，其余菌株均可以生长。当含盐率达到20%时，只有菌株j65可以生长。

由表4可知，当pH在6～10时，除菌株gu8在pH为10时不可以生长外，所有菌株均可以生长。当pH大于11时，所有菌株均不能生长。

3 小结与讨论

通过不同培养基对海泥样品中的微生物进行分离、纯化和抑菌试验，筛选出9株具有抑菌活性的微生物。其中8株菌株对大肠杆菌有一定的抑菌作用，5株菌株对葡萄球菌表现出一定的抑菌活性，有4株菌株对二者均有一定的抑制作用，其中菌株gu6和j65活性最优。16S rRNA序列分析表明，本研究分离到的两株高活性菌株gu6和j65分别属于芽孢杆菌和栖盐田菌属，且由于生理生化特征的特殊性，可能为潜在的新种[5]。表明中国南海地区微生物具有独特性和多样性，在后续研究中，可以对这一特殊环境的微生物进行全面系统的研究。

通过对9株菌株盐和pH的耐受性研究，发现菌株对酸碱变化、高盐度均具有一定耐受性，对常见的致病菌具有较好的抑菌作用，易于培养。但菌株的其他生理生化特征和抑菌机理均有待进一步研究。以期在益生菌制剂、畜禽养殖等病害防治领域开发具有应用前景的抗菌产品。

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