山茶灰斑病病原菌鉴定及防治药剂初步筛选

Z'�+���z�j&��6�*��˃�jg��&�a��f��ơj����Z���'^��h�۠jX�hơj����J|�y�� �.���m5��H��z�ږ�ڞ�+������z�nn�b�ן�:ڞ�Z�*'zZ'��b�w�r�+��iըky"http://www.film1981.com/doc/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1 病原菌分离纯化

采用单孢分离法对病原菌进行分离和纯化[7]，获得3株菌株（编号为LPSU 2014016、LPSU 2014023、LPSU 2014024）。菌株在PDA斜面上培养7～10 d后置于4℃保存。

1.2 病原物形态学鉴定

1.2.1 菌株活化与生长速率测定

将4℃条件下保存的3个菌株转接至2% PDA（新鲜马铃薯20 g煮汁过滤后加入2 g蔗糖，15 g琼脂，用水定容至1 000 mL）平板，于25℃恒温培养7 d后以5 mm直径打孔器从菌落边缘打取菌块，接入另一PDA平板中央，5个重复，25℃下黑暗培养7 d，测量菌落直径，观察菌落特征。

1.2.2 产孢细胞及分生孢子的诱导

将4～6根经双重灭菌的松针置于SNA培养基（KH2PO4 0.2 g，KCl 0.2 g，KNO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 蔗糖0.4 g，琼脂15 g，用水定容至1 000 mL）平板表面诱导其产生分生孢子[8]。待松针上有黑褐色孢子堆形成后在体视镜下挑取孢子堆制片，用正置显微镜（Olympus BX51）拍摄产孢细胞和分生孢子的显微结构，并测量大小。

1.3 病原菌的分子鉴定

1.3.1 病原菌DNA提取

将供试菌株分别接种于PDA平板上，置于25℃恒温培养7 d后刮取菌丝，用改良的CTAB法提取DNA[9]。

1.3.2 基因组DNA检测

取2 μL总基因组DNA样品进行电泳检测 （1.2%琼脂糖凝胶、0.5×TAE电泳缓冲液，5 V/cm电压）。

1.3.3 目的基因的扩增与序列测定

扩增的目的序列分别为ITS、β-tubulin和tef1三个基因片段。ITS基因选用真菌rDNA-ITS 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）;β-tubulin基因选用引物BT2A（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）;tef1基因选用引物EF1-526F（5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′）和EF1-1567R（5′-ACHGTRCCRATA-CCACCRATCTT-3′）[10]。PCR扩增反应体系（25 μL）：正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板2 μL。扩增ITS的PCR 反应条件：94℃预变性3 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环;最后72℃延伸5 min。扩增β-tubulin的PCR 反应条件：95℃预变性4 min;94℃变性48 s，55℃退火48 s，72℃延伸60 s，35个循环;72℃延伸5 min扩增tef1的PCR 反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性18 s，54℃退火33 s，72℃延伸30 s，35个循环;最后72℃延伸7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由成都柏辉生物科技有限公司进行纯化和测序。

1.3.4 序列分析

将本试验分离的3个菌株所测得的ITS、β-tubulin和tef1序列与从GenBank中下载的33个模式菌株或公认菌株对应的基因序列（表1）用Clustalx 2.0软件进行比对，以Neopestalotiopsis magna Maharachch.， K.D.Hyde & Crous（菌株号：MFLUCC 120652）为外类群，以Paup*4.0 beta 10软件以最大简约法（maximum parsimony， MP）进行分析，以启发式搜索法（heuristic search）构建系统发育树，分析供试菌株的分类地位[11]。

1.4 杀菌剂对病原菌室内药效测定

采用含药PDA平板测定杀菌剂药效[12]。参照商品农药推荐使用浓度范围，6种杀菌剂及其有效成分浓度梯度分别设置为：50%多菌灵可湿性粉剂62.5、125、250、500、1 000 mg/L;70%甲基硫菌灵可湿性粉剂75、150、300、600、1 200 mg/L;75%百菌清可湿性粉剂75、150、300、600、1 200 mg/L;70%代森锰锌可湿性粉剂62.5、125、250、500、1 000 mg/L;15%三唑酮可湿性粉剂50、100、150、200、250 mg/L和37%苯醚甲环唑水分散粒剂5、15、25、50、100 mg/L。在60℃的PDA培养基中分别添加相应质量的商品制剂，混合后制成含药平板，以添加无菌水为对照组，每个处理3个重复。以5 mm直径打孔器打取活化的纯培养物接种到含药平板，在25℃下避光培养7 d后用十字交叉法测定各平板上菌落直径，并计算抑菌率[13]，若产生孢子堆，则计算分生孢子堆密度。数据运用DPS v 7.05以LSD法进行单因素方差分析。

抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-5 mm）×100%;

分生孢子堆密度（个/mm2）=孢子堆数量/菌落面积。

2 结果与分析

2.1 山茶灰斑病的发病症状

如图1所示，在山茶叶片上，叶部病斑近圆形或不规则形，多从叶片边缘开始形成并逐渐扩大，初期水渍状，呈黑褐色，病健交界明显，后期病斑部位扩大并逐渐干枯呈灰色，叶表皮组织易脱落，严重者形成缺刻或穿孔。病斑内形成球状隆起的小黑点，分布稀疏，直径300～1 500 μm不等。叶部病斑小黑点部位横切面可见分生孢子盘，孢子盘上可清晰看到产孢细胞和未脱落的分生孢子，分生孢子（15～20）μm×（5～6）μm，呈梭形，具有4个隔，5个细胞，中部细胞颜色呈深棕色，顶端有附属丝1～3条，具有显著的拟盘多毛孢属真菌特征。

2.2 山茶灰斑病病原菌的形态学鉴定

山茶灰斑病分离菌株形态学特征如图2所示。3株菌株在2%PDA培养基上培养7 d后，菌落平均直径均为（7.65±0.23）cm（n=5），生长速度为（10.92±0.35）mm/d。培养物菌落呈同心环状，疏松，绒毛状，未产分生孢子堆，菌落背面淡黄色（图2a），初步鉴定3株菌株属于同一个种。

在SNA培养基中的松针上所形成的孢子堆呈黑褐色球形，直径200～500 μm，为半流动状的黑色黏液团，其基部嵌入松针表皮生长（图2b）。在显微镜下，其分生孢子梗倒棍棒状，有隔，透明，基部1～2个不规则分支，长短不一。产孢细胞簇生，呈球形、圆柱形或安瓿瓶状，长度8.0～20.0 μm （±SD=13.52 μm±3.68 μm，n=15），透明，宽2.2～4.6 μm（±SD=2.99 μm±0.75 μm，n=15）（图2c～d）。分生孢子纺锤形，直，偶稍有弯曲，4个隔将分生孢子分为5个细胞，分生孢子大小为（16.3～22.5）μm×（4.4～7.1）μm （±SD=（20.5±2.1）μm×（5.4±0.7）μm， n=30）;基部细胞倒圆锥状，与中部细胞之间接触平截面较小，长度2.5～5.4 μm （±SD=4.3 μm±0.6 μm， n=30），透明，薄壁。中间3个细胞呈瓮状至近圆柱形，厚壁且有小疣突，长度10.2～17.3 μm （±SD=12.5 μm±1.6 μm， n=30），隔处略微缢缩，3个细胞颜色相同，浅棕黄色至深棕黑色，隔膜较周围细胞颜色更深，其中第2个细胞长2.9～5.8 μm （±SD=4.4 μm±0.7 μm， n=30），第3个细胞长3.5～5.9 μm （±SD=4.2 μm±0.5 μm， n=30），第4个细胞长3.3～5.6 μm （±SD=3.9 μm±0.6 μm， n=30）。顶部细胞圆锥状，隔膜处显著收缩，细胞壁较薄、光滑，细胞呈透明状，长度2.8～5.3 μm （±SD=1.7 μm±0.6 μm， n=30）。顶部细胞顶部具1～3根管状附属丝，透明，尖端丝状，附属丝从顶部细胞的顶部共点分支或从主附属丝上多回分支，长度10～25 μm （±SD=15.3 μm±3.9 μm， n=30）。基部附属丝（中生柄）无或1条，透明，管状，长度1～4 μm （±SD=2.4 μm±1.5 μm， n=30），分生孢子基部中生（图2e～l）。

通过对代表性菌株的进一步培养和显微形态观察，并与该属已知种相比较，将所分离的3株菌株初步鉴定为Pestalotiopsis portugalica Maharachch.， K. D.Hyde & Crous[6，8]。

2.3 病原菌多基因分子系統学分析

将本试验分离的3株菌株所测得的ITS、β-tubulin和tef1序列与从GenBank中下载的33个模式菌株或公认菌株对应的基因序列用ClustalX 2.0进行比对，以Neopestalotiopsis magna Maharachch.， K.D.Hyde & Crous（菌株号：MFLUCC 12-0652）为外类群，并以Heuristiv Search构建的系统发育树如图3所示。在该树中，本研究分离的3个菌株（LPSU 2014016、LPSU 2014023、LPSU 2014024）都与P.portugalica模式菌株及其他菌株聚为一支，支持率为100%，支持了形态学鉴定结果。

2.4 菌株对不同杀菌剂的敏感性

如表2所示，与对照相比，所有处理下菌株LPSU 2014023的菌落直径都显著减小，其中50%多菌灵WP和70%甲基硫菌灵WP的4个高浓度（有效成分，下同）和其他4种杀菌剂的最高浓度处理直接导致接种的菌饼上的菌丝死亡，抑菌率100%。当75%百菌清WP浓度降低至75 mg/L，70%代森锰锌WP浓度降至125 mg/L，15%三唑酮WP浓度降至150 mg/L和37%苯醚甲环唑WG浓度降至25 mg/L时对病原菌抑制率降低至85%以下，防效显著降低。说明在推荐浓度范围内，50%多菌灵WP和70%甲基硫菌灵WP对该病原菌的抑制效果最佳，而70%代森锰锌WP、15%三唑酮WP和37%苯醚甲环唑WG在推荐浓度范围内抑菌效果相对较差。此外，从表2中还可以看出，浓度为250～500 mg/L的70%代森锰锌WP和75～300 mg/L的75%百菌清WP可显著促进培养物产孢。

3 讨论

拟盘多毛孢属真菌广泛分布于自然界，属寄生性较弱的半知菌。传统上对拟盘多毛孢属真菌进行分类以分生孢子大小、中间3个细胞的颜色和长度、附属丝长度和形状等形态特征作为依据，并将拟盘多毛孢属真菌分为三大类有显著区别的进化群，第一个类群分生孢子的中间3个细胞呈颜色均匀的浅棕色或橄榄色，第二个类群为颜色均匀的暗黑色，第三个类群为杂色[14]，本文报道的3菌株即属于第三个类群。但随后多基因序列分析证明以颜色来进行分类是不可靠的[10]，而且这些形态特征与菌株培养环境有关。山茶灰斑病主要由拟盘多毛孢属真菌引起，已报道的拟盘多毛孢属病原有污斑拟盘多毛孢[2]、白珠树拟盘多毛孢[3]、长刚毛拟盘多毛孢[4]、山茶拟盘多毛孢[5] 和葡萄牙拟盘多毛孢[6]。本文采用传统形态学特征，结合ITS、β-tubulin和 tef1多基因序列分析确定山茶灰斑病的病原菌为葡萄牙拟盘多毛孢P.portugalica。

目前已知的葡萄牙拟盘多毛孢全部分离自山茶属植物[15]，该真菌模式菌株（CBS393.48）最早于1948年采自葡萄牙，后由Maharachchikumbura等对其进行系统的分类研究[6]。在分类学上，其近缘种有P.camelliae，P. furcata和P.novae-hollandiae，P.portugalica与3个近缘种的分生孢子结构相似，且顶端附属丝数量较少，不过3个近缘种的分生孢子大小分别为（23～34）μm×（5.5～9.0）μm[5，8]、（29～39）μm×（8.5～10.5）μm[16]和（25～32）μm×（8～10）μm[6]，与P.portugalica的分生孢子大小有明显的区别。Liu等[8]从采集自江西省庐山植物园的山茶上分离到该种（菌株号：LC4360和LC0670）。本研究首次在我国西南地区从山茶灰斑病病斑上分离到葡萄牙拟盘多毛孢。

多菌灵和甲基硫菌灵都属于苯丙咪唑类杀菌剂，其作用机理都是抑制真菌细胞β-微管蛋白合成，阻碍正常有丝分裂[17]。从本研究试验结果来看，在推荐浓度范围内，苯丙咪唑类杀菌剂对菌株LPSU 2014023的抑制效果最佳，这与前人获得的药剂对拟盘多毛孢属病原菌室内抑菌效果一致[1819]。但苯丙咪唑类杀菌剂在人畜安全性上一直被人们所诟病，而且作用位点单一，病原菌极易产生抗性[20]，Omatsu等研究表明分离自日本鹿儿岛市茶叶种植区的P.longiseta菌株已对苯丙咪唑类杀菌剂产生抗性[21]。百菌清可破坏真菌细胞中的三磷酸甘油醛脫氢酶（GAPD）活性，使真菌细胞糖代谢受损[22]。在该试验中百菌清在推荐浓度范围内对所分离的病原菌表现出较好的抑制效果。代森锰锌可抑制真菌细胞丙酮酸的氧化，且锰和锌元素可促进植物生长及提高抗性，多位点保护，不易产生抗药性[23]，本试验表明70%代森锰锌WP在1 000 mg/L以上才能达到100%的抑制效果，而在250～500 mg/L浓度下会促进所分离的病原菌产孢，增强其对不良环境的抵抗能力。三唑酮和苯醚甲环唑都是真菌甾醇生物合成抑制剂[24]，可导致真菌细胞裂解死亡，本研究表明，在推荐浓度范围内这两种甾醇合成抑制剂抑菌效果并不理想。鉴于此，建议在拟盘多毛孢属真菌引起的病害防治中，应多种杀菌剂混合使用或交替使用，以提高防治效果和避免产生抗药性。

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（责任编辑：杨明丽）

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