一株产黑色素海洋细菌的初步鉴定

摘要：从波罗的海近海海水中分离出1株产黑色素的海洋细菌。该菌株可利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等碳源，H2S、V.P. 及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，为革兰氏阴性细菌，经16S rDNA初步鉴定后命名为Rheinheimera sp. 09BSZB-9，并对其产生的黑色素作了初步研究。

关键词：海洋细菌；黑色素；鉴定；Rheinheimera

中图分类号：Q93-3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3046-03

黑色素广泛存在于自然界生物体内，是一类由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色素[1]。它是医药、农业及化妆品行业的一种生产原料。从动植物体内提取黑色素的生产过程繁琐、成本高，而微生物所产的黑色素一般是由胞内酶催化形成的氨基酸的衍生物。产黑色素的微生物资源丰富，生产工艺简单易行，产品无毒害，稳定性好。因此研究微生物发酵产生黑色素具有很大的优势[2-4]。人们对陆境产黑色素的微生物研究较多，对海洋中产黑色素的微生物报道较少。本试验研究从波罗的海分离的一株着色菌科细菌，该菌具有产黑色素的能力，在生理生化特征及16S rDNA序列等方面与Rheinheimera chironomi相近，以期为海洋微生物黑色素研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 菌株ZB-9由本实验室的刘斌分离于波罗的海（E12.687 5°，N54.429 8°）海水。

1.1.2 主要试剂和仪器 DNA Marker、dNTPs、Taq酶等购自Takara公司；PCR纯化试剂盒购自Omega公司；Biometre公司PCR扩增仪（T3）；Eppendorf公司微型台式离心机；日本JEOL公司JEM-1230透射式电镜；德国Bruker公司TENSOR 27型红外光谱仪。

1.1.3 培养基 2216E细菌培养基、Tyr发酵培养基[5]、酪素培养基[6]、LB培养基均按人工海水和蒸馏水各半配制，121 ℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指标的测定 参照文献[7、8]对菌株ZB-9进行生理生化实验测定。

1.2.2 形态特征观察及发酵 将菌株ZB-9接种于LB培养基，24 ℃培养2 d，利用显微镜及透射电镜观察菌体形态并拍照。将菌株涂布于221 6E平板，24 ℃活化2 d，转接试管培养2 d，再将菌液接种于1.1.3的4种液体培养基中，24 ℃，150 r/min摇瓶培养至菌液呈黑色。

1.2.3 16S rDNA序列分析 细菌基因组DNA的提取参照文献[9]的方法。PCR扩增的通用引物：27F，1492R；PCR反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒纯化后，送交上海博亚生物技术有限公司完成序列测定。所测得的序列提交至GenBank，获得登录号，并与数据库EzTaxon Server Version 2.1中已有序列进行BLAST比对分析，选取同源性较高的16S rDNA序列作为参比对象，运用DNAMAN进行多重序列分析，通过MEGA 4.0软件，采用邻接法构建系统进化树[10]。

1.2.4 黑色素的提取与鉴定 参照文献[11、12]方法提取黑色素；取少量提取的黑色素纯品，用溴化钾压片法测其红外吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 菌株的生理生化特征

挑新鲜菌落于3%的KOH中出现拉丝现象，为革兰氏阴性菌，H2S、V. P.及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，铜离子（0.1 g/L）会抑制其生长。对麦芽糖、蔗糖及纤维二糖利用较好，不能利用淀粉、柠檬酸（表1）。菌株在酪氨酸培养基上适宜生长温度为4～40 ℃。菌落较小，湿润、光滑、圆形突起、边缘整齐，菌体之间粘连成团，易挑取整个菌落，呈黑色（起初白色，产黑色素后呈黑色，图1）。

2.2 菌株的形态及发酵特性

菌体宽0.8～1.4 μm，长0.8～2.4 μm，电镜下菌体周围有分泌物，单端鞭毛（图2）。菌株在4种液体培养基中均产生黑色素，其中较好的是Tyr发酵培养基。

2.3 菌株的鉴定结果

该菌株的16S rDNA序列长度为1 358 bp，GenBank登录号为HM566014。将该序列与数据库EzTaxon Server Version 2.1相关序列进行BLAST分析，选取同源性高的9株菌的16S rDNA序列构建系统发育树，如图3所示，该菌株与R. chironomi处于进化树的同一分支，同源性99.853%，与R. pacifica的同源性97.035%。除产黑色素同R. chironomi有别外，其他生理生化及形态特征差别不大。

2.4 黑色素的鉴定结果

红外光谱分析表明，样品在3 300～3 400 cm-1、1 640 cm-1附近有强吸收峰，在1 382 cm-1、1 450～1 600 cm-1、2 900 cm-1附近有弱吸收峰；1 238 cm-1附近有中强吸收峰（图4）。据文献报道3 300 cm-1处的吸收峰是因为-OH、-NH2的伸展振动引起，1 643 cm-1处吸收峰主要是C=C、-COO-、C=O伸展振动引起，与文献[13]的红外光谱图相似，说明其主要功能团基本一致。

3 讨论

在菌株的培养特征、生理生化特征和细胞特征的基础上，结合16S rDNA序列分析结果，菌株ZB-9与R. chironomi[14]比较相似，而与R. pacifica差别很大（表1）。暂命名为Rheinheimera sp. 09BSZB-9。

该研究首次发现色菌科细菌可产黑色素，在酪氨酸存在的条件下黑色素产量较好。黑色素越来越受到人们的青睐，与从动植物中提取的方式相比，利用微生物发酵生产黑色素具有快速、简便、易提取等特点，且细菌、放线菌产生的黑色素可分泌到胞外，无需破碎细胞，便于提取。下一步将对ZB-9产黑色素的发酵条件做细化研究，为其开发应用打下基础。

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