百合枯萎病病原菌分离鉴定及药剂室内筛选

材料与方法

1.1 材料

从江西省万载县白水乡百合基地采集枯萎病龙牙百合鳞球，采用PDA培养分离、提纯病原菌。对15种药剂进行室内抑菌试验，供试药剂见表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离和纯化 病原物的分离参照文献[5]和[6]的方法进行。病原物的纯化，主要通过切取菌丝段或挑取单孢进行纯培养，纯化后的菌种转移到PDA斜面培养基上保存。

1.2.2 分离病原菌的鉴定 培养性状及形态学观察，根据分离真菌在PDA培养基上的菌丝生长情况和孢子显微形态进行鉴定。

病原菌的分子生物学鉴定，采用真菌核糖体基因内转录间隔区（ITS）通用引物ITS1和ITS4扩增病原菌并测序，在NCBI网站，用BLAST软件与GenBank中已知种属的rDNA进行序列比对和同源性分析。病原菌ITS全序列分析委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

1.2.3 柯赫氏法则验证 根据柯赫氏法则，将健康百合鳞片接种至长满菌丝的草炭、珍珠岩的混合基质内，25 ℃恒温培养，选取出现相同症状的鳞片进行病原菌的再次分离鉴定。

1.2.4 杀菌剂的室内毒力测定 在预备试验的基础上，选择对百合枯萎病菌菌丝生长的抑制率在5%～95%范围内的不同杀菌剂；每种药剂分别取不同的浓度，在18 mL PDA培养基（55 ℃）中加入2 mL药剂，分别倒入3个直径为90 mm的培养皿内（3次重复），静置30 min后在平板中央放5 mm的菌饼，于25 ℃下倒置培养，对照处理的菌丝生长直径大于50 mm后，量取各平板中菌落的直径，以加入灭菌水的培养基平板为对照，计算抑菌率。将抑菌率换算成机率值、药剂浓度换算成对数值进行计算[7，8]；利用SPSS 19.0软件求出毒力回归方程、相关系数和EC50，并对常用药剂浓度下的抑菌率进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果

从百合病株中分离得到丝状真菌，菌株之间形态差异较大，气生菌丝白色、粉色至紫色，丝绒状、羊毛状或毡状，培养基表面无色或淡紫色，菌落背面粉色或紫色。小型分生孢子0～1分隔，卵圆形或肾形，假头生，5.0～17.5 μm×2.0～5.0 μm。大型分生孢子纺锤形或稍弯，较匀称，具2～5个隔膜，22.5～40.0 μm×2.5～6.0 μm（图1、图2）。

2.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

为进一步确定分离得到的病原菌是否为尖孢镰刀菌，从分离到的菌株中随机抽取菌株，克隆并分析了该菌的rDNA-ITS序列。菌株的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、测序，该序列全长为566 bp。将菌株的核糖体DNA-ITS基因在Genbank中进行同源性比较，发现与其同源性最高的100个ITS序列菌株全部为茄腐皮镰刀菌属菌（AB470903.1、EF152426.1、AJ608989.1、KP132235.1、AB470904.1、KJ680136.1、AB518683.1），与它们的同源性为99%。菌株核糖体DNA-ITS序列与尖孢镰刀菌（DQ452447.1）的同源性为99%。结合培养性状等形态学特征和ITS区域的DNA序列分析，证明所分离到的菌株为尖孢镰刀菌[9]（图3、图4）。

2.3 柯赫氏法则验证结果

用纯化的菌株回接健康的百合鳞片，表现出相同的腐烂症状。从感病百合鳞片上再分离的菌株在PDA培养基上的培养特性与纯化菌株一致，镜检后观察到相同形态特征的分生孢子，故判断引起万载百合枯萎病的病原菌就是尖孢镰刀菌。

2.4 杀菌剂的室内筛选结果

室内毒力测定结果（表2）表明，10种药剂对尖孢镰刀菌均有一定的抑制作用，且随浓度的增加抑制作用增强，其相关系数均在0.900以上。但不同药剂之间的抑制作用差异较大，其中氟硅唑抑制作用最强，EC50为2.226 mg/L；其次是绿群，EC50为3.140 mg/L；再次是适乐时，EC50为4.015 mg/L；氟吗·唑菌酯的效果最差，EC50为2 324.538 mg/L。其余5种参试药剂因试验结果相关系数过低，故未列入表中。

对参试15种杀菌剂常用浓度进行抑菌率试验，并进行方差分析。结果（表3）表明，广清、绿群抑菌率显著高于其他参试药剂；广清、绿群、洛菌腈和唑醚·代森联抑菌率极显著高于其他参试药剂，抑菌率分别为96.57%、94.34%、84.71%、84.56%、79.84%；腈苯唑和苯甲·嘧菌酯抑菌率大于60%，极显著高于诺德·苗斯达、多菌灵、氰霜唑、中生菌素、啶氧菌酯、氟吗·唑菌酯、烯唑醇和噁霉灵；诺德·苗斯达、多菌灵、氰霜唑、中生菌素、啶氧菌酯、氟吗·唑菌酯、烯唑醇和噁霉灵抑菌率均小于60%。

3 小结与讨论

多菌灵、噁霉灵、中生菌素用于防治镰刀菌引起的百合枯萎病有良好的防效[7，10，11]。但本试验使用上述杀菌剂防治效果不佳。

申嗪霉素（广清、绿群）作为一种新型微生物源绿色农药对镰刀菌引起的西瓜枯萎病、番茄枯萎病有很好的防效[12，13]。本试验表明，其室内抑菌试验结果与前人研究类似，对镰刀菌引起的百合枯萎病也具有优异的防效。

三唑类杀菌剂是一类重要的内吸性杀菌剂，烯唑醇[7]、丙环唑[14]等对镰刀菌引起的百合枯萎病具有良好的防效。本试验选用氟硅唑、腈苯唑进行试验，其药效显著优于烯唑醇，为百合枯萎病的有效防治增添了新的三唑类杀菌剂。

目前，适乐时悬浮种衣剂在百合生产上主要用作种球处理[15]，也用于黄瓜枯萎病[14]、西瓜枯萎病[16]防治，具有良好的防效，本试验证明其室内抑制枯萎病菌药效优异。

试验采用毒力回归方程和方差分析两种方法进行试验分析，能较好地发挥各自优势。采用EC50较好体现了抑菌率为50%时参试药剂的剂量，通过用药量的多少进行药效判断，但当参试药剂药效较差时，可能会使部分药液浓度的抑菌率均很低，从而不利于生成回归方程；利用方差分析方法、采用常用药剂浓度进行抑菌率试验，能比较各参试农药抑菌率差异。二者结合应用，较好地比较了多菌灵、噁霉灵、中生菌素等药剂的抑菌率。

本研究以传统的形态学特征为基础，对百合枯萎病菌的rDNA-ITS序列进行分析和比对，从分子生物学水平上进一步明确万载百合种植基地百合枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。选用15种杀菌剂对该病原菌进行室内毒力测定，筛选出适宜药剂，为该病的田间防治和抗性品种选育提供理论依据。氟硅唑、广清、绿群、苯甲·嘧菌酯、唑醚·代森联、适乐时、腈苯唑防治百合枯萎病为首次报道。

致谢：百合枯萎病病原菌菌种鉴定得到宜春学院邹一平教授的指导，特此致谢。

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