马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ法对广东烟草样品的马铃薯Ｙ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ，ＰＶＹ）辅助成分蛋白质（Ｈｅｌｐｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＨＣ－Ｐｒｏ）基因进行了克隆，并对其进行了序列分析。测序结果表明广东ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ（命名为ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ）基因（用ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ表示）全长１ ３９５ ｂｐ，编码４６５个氨基酸。与已报道的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因核苷酸序列相比发现，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与ＰＶＹ ＮＴＮ株系（ＰＶＹＮＴＮ）（ＡＢ３３１５１７）的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因核苷酸序列相似性最高，达９９．６％。而氨基酸序列比较表明，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与ＰＶＹ Ｎ株系（ＰＶＹＮ）（ＡＭ２６８４３５）的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ氨基酸序列相似性最高，为９９．１％。进一步将ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树，结果显示广东烟草样品中ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与ＰＶＹＮＴＮ ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ亲缘关系最近。

关键词：马铃薯Ｙ病毒；广东烟草样品；ＨＣ－Ｐｒｏ基因；克隆；序列分析

中图分类号：Ｓ５３２；Ｓ４３２．４＋１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）20－4298-04

Cloning and Sequence Analysis of HC-Pro of PVY-GD Isolate

ＧＵＯ Ｘｉａｏ－ｊｉａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｏｎｇｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｈｅｌｐｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＨＣ－Ｐｒｏ） ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ（ＰＶＹ） ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＨＣ－Ｐｒｏ ｏｆ ＰＶＹ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ） ｗａｓ １ ３９５ ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ４６５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ ＮＴＮ （ＡＢ３３１５１７） （９９．６％）， ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ Ｎ （ＡＭ２６８４３５） （９９．１％）． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ ａｎｄ １７ ｏｔｈｅｒ ＰＶＹ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ ｈａｄ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ ＮＴＮ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ； tobacco leaves in Guangdong； ＨＣ－Ｐｒｏ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

马铃薯Ｙ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ，ＰＶＹ）是植物病毒最大属马铃薯Ｙ病毒属（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）的典型成员。Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ成员还与其他病毒间有协生作用，它通常作为激发病毒促进另一种异源病毒的复制，而其复制水平不变或稍有降低，如ＰＶＹ就和马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）之间存在协生作用，研究发现ＰＶＹ促进ＰＶＸ的侵染，使ＰＶＸ的危害加重，而ＰＶＸ对ＰＶＹ则无影响，即ＰＶＹ介导ＰＶＹ／ＰＶＸ的协生作用［１－４］，病毒间的协生作用加剧了农作物病毒病的危害，造成了巨大的经济损失。目前ＰＶＹ在全球范围内已成为马铃薯、烟草和辣椒等茄科作物病毒病的主要病源之一，并且在中国范围内烟草遭受ＰＶＹ危害呈逐年上升趋势。

根据ＰＶＹ的鉴别寄主反应、血清学反应和引起的症状类型将其分为多个株系，常见马铃薯Ｙ病毒Ｏ株系（ＰＶＹＯ）、马铃薯Ｙ病毒Ｎ株系（ＰＶＹＮ）和马铃薯Ｙ病毒Ｃ株系（ＰＶＹＣ）三种株系。另外又有两种株系，如马铃薯Ｙ病毒ＮＴＮ株系（ＰＶＹＮＴＮ）最早于20世纪80年代在匈牙利被发现［５］，其与ＰＶＹＮ具有血清学关系，在烟草上引起叶脉坏死［６，７］。马铃薯Ｙ病毒Ｎ：Ｏ株系（ＰＶＹＮ：Ｏ）在烟草上引起类似于ＰＶＹＮ的叶脉坏死症状，但血清学鉴定发现它与ＰＶＹＮ没有血清学关系，而与ＰＶＹＯ具有血清学关系［８，９］。

ＰＶＹ由单一的外壳蛋白和一条正链ＲＮＡ组成，整个病毒基因组只有一个阅读框，翻译产生一个巨大的多聚前体蛋白质，通过加工裂解成不同功能的成熟蛋白质，随着对ＰＶＹ分子生物学研究的深入，对不同蛋白质也有一定的了解，其中辅助成分蛋白（Ｈｅｌｐｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＨＣ－Ｐｒｏ）是一种７５ｋＤ的多肽，为一种多功能的蛋白质［１０］。它的Ｎ端控制蚜虫传播和病毒的复制；Ｃ端是一种半胱氨酸类型的蛋白酶，具有蛋白酶活性，以顺式方式催化自身的断裂［１１］，中心区域参与病毒细胞间和长距离运输，也是介导病毒协生作用的功能区，在协生作用中起主导作用［１２］，近期发现ＨＣ－Ｐｒｏ还可以作为病毒转录后基因沉默（ＰＴＧＳ）的抑制子［１３，１４］。

通过ＲＴ－ＰＣＲ技术从广东烟草上克隆ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ（命名为ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ）基因（用ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ表示），并进行ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的序列分析，对进一步研究ＰＶＹ株系种类、蚜虫传毒机制、ＰＶＹ与寄主互作机制以及病害流行学具有重要的意义。同时，也为利用基因工程技术进行抗病毒育种来防治ＰＶＹ的危害提供了理论基础。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１病样采集２００８年５月从广东省南雄市烟田采集叶片呈现叶脉坏死症状的烟草，病叶保存于－８０ ℃冰箱备用。

１．１．２菌种及载体转化受体大肠杆菌ＤＨ５α由仲恺农业工程学院生物科学实验室制备，克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ购自宝生物工程（大连）有限公司（ＴａＫａＲａ公司）。

１．１．３酶与试剂Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶等工具酶购自鼎国生物有限公司，逆转录试剂盒购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，琼脂糖凝胶ＤＮＡ纯化回收试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．２方法

１．２．１植物总ＲＮＡ的提取采用Ｔｒｉｚｏｌ方法提取烟草总ＲＮＡ。

１．２．２引物的设计与合成从ＮＣＢＩ的ＧｅｎＢａｎｋ上下载ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ序列，根据ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ两侧的保守序列设计一对特异性引物ＨＣ／Ｆ和ＨＣ／Ｒ。引物序列如下，ＨＣ／Ｆ：５′－ＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴ-

ＣＴＡＴ－３′，ＨＣ／Ｒ：５′－ＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＧＡＣＣＣＡ－３′，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

１．２．３ｃＤＮＡ的合成及ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的ＰＣＲ扩增用Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ的逆转录试剂盒在Ｍ－ＭｕＬＶ逆转录酶作用下合成ｃＤＮＡ第一链，具体方法参照Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ的逆转录试剂盒的操作说明。ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ用ＨＣ／Ｆ和ＨＣ／Ｒ进行ＰＣＲ扩增。

１．２．４ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的克隆对ＰＣＲ产物进行０．８％琼脂糖凝胶电泳，用ＤＮＡ纯化回收试剂盒回收目的片段，然后与载体ｐＭＤ１８－Ｔ连接，再转化大肠杆菌ＤＨ５α，最后筛选阳性克隆。

１．２．５序列测定和分析阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，再利用ＤＮＡＳｔａｒ软件Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｖ进行序列相似性比较。进化树构建利用ＤＮＡＭＡＮ软件进行。用于序列分析的PVY ＨＣ－Ｐｒｏ来源株系（登录号）为：ＰＶＹＣ（ＡＪ８９０３４８）；ＰＶＹＮ：Ｏ（ＡＹ７４５４９１和ＡＹ７４５４９２）；ＰＶＹＮ（ＡＪ５８５１９７、ＡＭ２６８４３５、ＥＵ１８２５７６

和Ｘ９７８９５）；ＰＶＹＮＴＮ（ＡＢ３３１５１７、ＡＢ３３１５１９、ＡＪ８８９８６６、

ＡＪ８９０３４３、ＡＪ８９０３４６、ＦＪ２０４１６４和ＦＪ２０４１６６）；ＰＶＹＯ（ＡＪ５８５１９６、ＡＹ５４７３２４和ＥＦ０２６０７４）。

２结果与分析

２．１ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的克隆

以逆转录的ｃＤＮＡ第一链为模板，用引物进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物进行０．８％琼脂糖凝胶电泳，可见一条约１ ５００ｂｐ的特异性扩增带（图１）。ＰＣＲ产物纯化后，与载体ｐＭＤ１８－Ｔ连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，菌落ＰＣＲ筛选出阳性克隆。

２．２序列比较及分子进化分析

利用上海生工生物工程技术服务有限公司的ＤＮＡ荧光自动序列分析仪测定阳性克隆全长为１ ４９０ ｂｐ。截去ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ两侧序列，研究从广东烟草上克隆到的ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ核苷酸序列全长１ ３９５ bp，共编码４６５个氨基酸（ＧｅｎＢａｎｋ序列登录号：ＦＲ６９４６７５）。利用ＤＮＡＳｔａｒ软件对ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ序列与其他１７个ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因核苷酸序列以及各自编码的氨基酸序列相比较，结果见表１。比较结果表明，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的核苷酸序列与ＰＶＹＯ和ＰＶＹＣ株系的相似性小于其余的株系，其中与ＰＶＹＮＴＮ（ＡＢ３３１５１７）的相似性最高，达９９．６％，而与ＰＶＹＯ（ＡＪ５８５１９６）的相似性最低，仅为７９．６％；ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ编码的氨基酸序列则与ＰＶＹＮ（ＡＭ２６８４３５）的相似性最高为９９．１％，与ＰＶＹＯ（ＡＪ５８５１９６）的相似性最低为８９．０％。

利用ＤＮＡＭＡＮ软件构建ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与其他ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因的核苷酸和编码的氨基酸序列系统进化树也可以看出，从广东烟草上克隆的ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与ＰＶＹＮＴＮ的PVY HC-Pro的亲缘关系最近（图２）。

３讨论

通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了广东烟草ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ，并对其进行了序列分析，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ全长

１ ３９５ ｂｐ，编码４６５个氨基酸，与文献报道的１７个ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因序列比较表明，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的核苷酸序列与ＰＶＹＮＴＮ（ＡＢ３３１５１７）的相似性最高，达到９９．６％，其编码的氨基酸序列与ＰＶＹＮ（ＡＭ２６８４３５）相似性最高，达到９９．１％。

从株系间亲缘关系的角度分析，由ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ和选取的其他１７个PVY HC-Pro基因核苷酸序列和编码的氨基酸序列构建的系统进化树的分析可知，无论是以基因的核苷酸序列还是编码氨基酸序列的构建系统进化树的结果，所有的１８个ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ聚成两个分支，其中ＰＶＹＣ和ＰＶＹＯ两株系形成一个分支，而ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与已报道的多个ＰＶＹＮＴＮ、ＰＶＹＮ和ＰＶＹＮ：Ｏ的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ聚为一类，形成另外一个分支，其中研究所得到的ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ与ＰＶＹＮＴＮ的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ有最近的亲缘关系。

由于ＰＶＹ不同株系发生混合侵染及不断有新的ＰＶＹ株系和亚株系被发现，ＰＶＹ株系的鉴定变得越来越复杂［１５，１６］。常用的鉴定方法有生物学鉴定、血清学鉴定及分子鉴定。ＰＶＹＮ和ＰＶＹＮＴＮ两个株系无法用血清学区分［１７］，通过分子鉴定发现ＰＶＹＮ：Ｏ是由ＰＶＹＯ和ＰＶＹＮＴＮ重组形成［８，１８］，这都说明ＰＶＹＮＴＮ、ＰＶＹＮ和ＰＶＹＮ：Ｏ三个株系有高度的同源性。目前研究者们将ＰＶＹＮＴＮ和ＰＶＹＮ：Ｏ归属为ＰＶＹＮ的两个亚株系。研究中ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因序列相似性比较和系统关系树分析也进一步说明ＰＶＹＮＴＮ、ＰＶＹＮ与ＰＶＹＮ：Ｏ株系之间差异性很小，ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因是否可以作为ＰＶＹ株系划分的依据还有待于进一步研究。

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